[发明专利]Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体及其在制备L-草铵膦中的应用

说明书

本申请涉及Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体及其在制备L‑草铵膦中的应用。所述Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体当与包含SEQ ID NO.5所示序列的Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶的氨基酸序列比对时，所述Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体的氨基酸序列包含对应于第91位和/或第168位的氨基酸残基的替换，所述第91位和第168位是参照SEQ ID NO.5限定的，并且所述Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.5所示序列具有至少90％的同一性。

技术领域

本申请涉及生物技术领域；特别地，本申请涉及Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体，所述Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体在制备L-草铵膦中的用途，以及一种利用所述Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(又名双丙氨膦、草丁膦，商品名包括保试达、百速顿等，英文名为phosphinothricin(简称PPT)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸)是德国赫斯特公司(现属于拜耳公司)在20世纪80年代开发的一种低毒、高效、非选择性触杀型有机磷除草剂。草铵膦作用于植株后可以抑制谷氨酰胺合成酶，从而中断植物体内谷氨酸的可逆反应，造成代谢紊乱，使植物堆积过量的氨而中毒，同时导致植物无法合成叶绿素从而光合作用受到抑制，导致植物死亡。草铵膦主要用于果园、马铃薯田、非耕地等，用于防治一年生和多年生的禾本科及双子叶杂草，如马唐、狗尾草、野小麦；多年生的禾本科杂草和莎草，如羊茅、鸭芽等。

灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦，但只有L-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。

手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。

手性拆分法需要使用价格昂贵的手性拆分剂(例如奎宁)，拆分的步骤非常繁琐(例如需要经历成盐、诱导结晶、解盐等步骤)，并且拆分的理论收率只有50％，这导致此路线的工业价值比较低。

化学合成法包括不对称合成法和天然氨基酸手性源法等，其缺点包括需要用到昂贵的贵金属和配体或起始原料，或反应路线需要剧毒物质，或反应合成路线较长等。

生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下两类：(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体；(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得，主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。

除了这两种传统的生物催化法，以D,L-草铵膦为原料的去消旋合成方法凸显了巨大的成本优势。由于市售的草铵膦为D,L-草铵膦，其工业化生产技术已十分成熟，去消旋合成方法直接以D,L-草铵膦为原料，简单易得，成本较低，能够较好对接现有草铵膦工业生产体系。

发明内容

本申请基于Glu/Leu/Phe/Val脱氢酶突变体的鉴定，这些突变体可用于改进L-草铵膦的生物酶法生产。