[发明专利]一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法

说明书

本发明公开了一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法，属于生物技术工程技术领域。所述指示质粒将GCaMP5G的编码基因插入pd2‑EGFP载体EcoR 1和Not 1的多克隆位点处构建；其中，所述GCaMP5G的编码基因如SEQ ID NO：1所示。通过将所述指示质粒引入真核细胞中，并使得所述包含GCaMP5G的载体稳定表达于所述真核细胞中，然后在G418存在的条件下筛选得到细胞系。该细胞系可以稳定表达钙离子指示质粒pd2‑GCaMP5G，并以绿色荧光的形式反应细胞内的钙离子水平，避免了反复的瞬时转染质粒，节省转染试剂等试验耗材、节约时间，为相关试验提供便利，对生物学研究也具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术工程检测技术领域，涉及一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法。

背景技术

钙离子是低等生物到高等生物生理功能中的二级信号传递信使，在机体内受到严格的调控以参与调控许多生命活动。机体内的钙离子一旦失控，就会引起机体的各种疾病。因此，细胞内钙离子水平一定程度上可以反映机体的健康状况，这在生理学和病理学上都有重要意义。

对于细胞内钙离子水平的检测，传统方法一般是将钙离子指示质粒通过脂质体转染法瞬时转染进细胞，但此法不能将质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，传代过程中容易造成质粒的丢失，重复操作耗时耗材。稳定细胞系构建是将外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上，细胞可长期表达目的蛋白，称稳定细胞系。高质量的稳定细胞系在生物学研究中扮演着非常重要的角色，包括基因功能研究、重组抗体、药物开发等。

现有技术中关于如何构建钙离子指示质粒单细胞稳定细胞系的报道还鲜少，因此，开发出一种转染效果好且具有良好传代稳定性的钙离子指示质粒单细胞稳定细胞系对生物学研究具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系构建方法，解决了背景技术中的问题，钙离子指示质粒能够以绿色荧光的形式在细胞中稳定表达，最终节省时间、节约耗材，成为有力的钙离子研究工具。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种指示质粒，将GCaMP5G的编码基因插入pd2-EGFP载体EcoR 1和Not1的多克隆位点处，构建指示质粒pd2-GCaMP5G；其中，所述GCaMP5G的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种所述的指示质粒的构建方法，包括以下步骤：

获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列；

将所述编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列和pd2-EGFP载体分别双酶切后，连接，再转化DH5α感受态细胞，经培养筛选阳性单克隆，获取钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G。

优选的是，获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列的引物如下：

上游引物：5’-ATGCGAATTCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3’，

下游引物：5-ATGCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTA-3’。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系稳定表达所述的指示质粒。

本发明还提供一种所述的细胞系的构建方法，包括以下步骤：

将包含编码GCaMP5G的基因的指示质粒引入真核细胞中，并使得所述指示质粒稳定表达于所述真核细胞中，然后在G418存在的条件下筛选得到细胞系。

优选的是，所述真核细胞为人源细胞。

进一步地，人源细胞为A549细胞。

优选的是，所述G418筛选浓度为1400μg/mL。