[发明专利]一种稳定表达钙离子指示质粒的细胞系的构建方法在审
| 申请号： | 202110457851.9 | 申请日： | 2021-04-27 |
| 公开（公告）号： | CN113174405A | 公开（公告）日： | 2021-07-27 |
| 发明（设计）人： | 李军伟;江乐;谭梦楠;马清霞 | 申请（专利权）人： | 青岛农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C12N5/10;G01N21/64;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京东方盛凡知识产权代理事务所(普通合伙) 11562 | 代理人： | 张换君 |
| 地址： | 266109 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 稳定 表达 离子 指示 质粒 细胞系 构建 方法 | ||
1.一种指示质粒，其特征在于，将GCaMP5G的编码基因插入pd2-EGFP载体EcoR 1和Not1的多克隆位点处，构建指示质粒pd2-GCaMP5G；其中，所述GCaMP5G的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种如权利要求1所述的指示质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列；
将所述编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列和pd2-EGFP载体分别双酶切后，连接，再转化DH5α感受态细胞，经培养筛选阳性单克隆，获取钙离子指示质粒pd2-GCaMP5G。
3.如权利要求2所述的指示质粒的构建方法，其特征在于，获取编码GCaMP5G的基因的核苷酸序列的引物如下：
上游引物：5’-ATGCGAATTCATGGGTTCTCATCATCATCATC-3’，
下游引物：5’-ATGCGCGGCCGCTCACTTCGCTGTCATCATTTGTA-3’。
4.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系稳定表达权利要求1所述的指示质粒。
5.一种如权利要求4所述的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将包含编码GCaMP5G的基因的指示质粒引入真核细胞中，并使得所述指示质粒稳定表达于所述真核细胞中，然后在G418存在的条件下筛选得到细胞系。
6.如权利要求5所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述真核细胞为人源细胞。
7.如权利要求5所述的细胞系的构建方法，其特征在于，所述G418筛选浓度为1400μg/mL。
8.一种如权利要求1所述的指示质粒的应用，其特征在于，应用于检测细胞系中钙离子含量水平。
9.一种利用权利要求4所述的细胞系检测钙离子含量水平的方法，其特征在于，所述细胞系稳定表达指示质粒pd2-GCaMP5G，通过检测所述细胞系中所述pd2-GCaMP5G的荧光表达水平反映钙离子含量水平。
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