[发明专利]DNase I突变体、其编码核苷酸序列及其应用

说明书

本发明通过对野生型DNase I相关位点进行突变，筛选得到了3个效果良好的突变体，其中两个为双位点突变，突变位点分别是A249T、R42H和A249T、F110V，1个为3位点突变，突变位点为A249T、R42H、F110V，其中3位点突变的DNase I突变体效果最佳，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。并公开了其在高通量测序文库构建中的应用。本发明的DNase I突变体可高效稳定打断基因组DNA，其片段化产物可应用于高通量测序文库构建，相比野生型DNase I，建库测序质量更优异，GC偏好性更低。可实现低成本，高效率建库，且测序质量优异。

技术领域

本发明专利涉及DNase I突变体、其编码核苷酸序列及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。利用该特性，可对基因组DNA进行随机打断，打断产物可应用于高通量测序文库制备。该方法操作简便，耗时短，成本低，摆脱了大型设备的依赖性，同时可实现一体化高通量操作，可有效的减少人力成本，提高建库效率。

现阶段相关文献及相关测试显示，DNase I应用于高通量测序文库制备虽然简单易行，但仍然存在部分弊端，即微量样本打断效果不够稳定，损失相对较大；酶切位点存在一定的偏好性，测序质量有待提升。

近几年，高通量测序技术正处于飞速发展的阶段，各种生物科学领域的研究或者临床检测领域都涉及到测序文库的构建及高通量测序服务，市场需求日益增长，同时对效率、成本、质量都提出了非常高的标准。基于市场提出的高标准，高要求，现急需开发一款稳定高效的基因组DNA打断酶。

发明内容

本发明通过对野生型DNase I相关位点进行突变，筛选得到了3个效果良好的突变体，其中两个为双位点突变，突变位点分别是A249T、R42H和A249T、F110V，1个为3位点突变，突变位点为A249T、R42H、F110V，其中3位点突变的DNase I突变体效果最佳，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，本发明对上述三个突变体性能进行详述。

其中野生型DNase I氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的DNase I突变体可用于高通量测序文库构建。

DNase I突变体用于高通量测序文库的步骤包括：

（1）基因组打断：在样本中加入上述的DNase I突变体，进行基因组打断；

（2）打断产物纯化：打断产物用磁珠纯化；

（3）末端修复加A：片段化产物使用试剂盒进行末端修复加A；

（4）接头连接：上一步产物用试剂盒的连接模块进行接头连接；

（5）接头连接产物纯化：接头连接产物采用磁珠纯化；

（6）文库扩增和分析。

优选的，步骤（1）中打断反应过程为：在样本中加入10×Fragment buffer 5μL，DNase I突变体0.6-1.6μL，补水至50 μL，将其置于PCR仪中进行打断，酶切温度30℃，失活温度80℃。

本发明的有益效果：