[发明专利]一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)-香茅醛的方法

说明书

本发明提供一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)‑香茅醛的方法。该大肠杆菌基因工程菌是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为出发菌株，对其基因组上的醇脱氢酶基因adhE进行敲除，还通过质粒pET28a整合来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH，以及通过质粒pET21a整合来源于假丝酵母的烯键还原酶HP3，获得一种可用于催化生产(R)‑香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，adhE、GDH、HP3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。根据本发明提供的方法，使用全细胞催化高浓度柠檬醛生产(R)‑香茅醛，柠檬醛的转化率在99％以上，(R)‑香茅醛的ee值在95％以上。

技术领域

本发明涉及酶工程和手性医药中间体制备技术领域，更具体地涉及一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)-香茅醛的方法。

背景技术

光学纯(R)-香茅醛是一种重要的香料及医药中间体，其可用于饮料、食品、香水等的调香，还可作为合成L-薄荷醇的原料。工业上主要由天然精油分离获得，也可由柠檬醛经金属催化剂催化加氢制得。

目前工业上催化柠檬醛生产(R)-香茅醛主要是通过金属催化剂催化柠檬醛加氢，相关利用生物催化法制备(R)-香茅醛存在底物浓度低、醛过度还原等问题。2010年，Stewart等人在大肠杆菌中表达Pichia stipitis的烯键还原酶，利用纯化后的烯键还原酶与葡萄糖脱氢酶进行催化反应，在反应5.75h后催化150mM E-柠檬醛的转化率达到95％(Chemical Communications,2010,46(45):8558-8560.)；该研究使用的是纯酶作为催化剂，并没有使用全细胞催化系统，且底物E-柠檬醛需由E/Z-柠檬醛分离获得，虽然产物(R)-香茅醛的光学纯度达到98％。但产量还是偏低。2016年，中国专利申请CN106086089A公开了利用氨基酸催化的柠檬醛顺反异构反应，通过在催化柠檬醛的反应中偶联此反应生产(R)-香茅醛。该发明可以以柠檬醛为底物生产(R)-香茅醛，但产物ee值还是偏低，仅为65.4％。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)-香茅醛的方法，从而解决现有技术中(R)-香茅醛的制备存在底物浓度低、醛过度还原、产物ee值偏低的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种可用于催化生产(R)-香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌是以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为出发菌株，对其基因组上的醇脱氢酶基因adhE进行敲除，同时还通过质粒pET28a整合来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶GDH，以及通过质粒pET21a整合来源于假丝酵母的烯键还原酶HP3，获得一种可用于催化生产(R)-香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，其中，所述醇脱氢酶基因adhE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述烯键还原酶HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的可用于催化生产(R)-香茅醛的大肠杆菌基因工程菌，是通过Crispr-Cas9介导的基因敲除方法实现大肠杆菌醇脱氢酶基因的缺失，从而得到醇脱氢酶缺失的大肠杆菌，并在所得的菌株中表达烯键还原酶及葡萄糖脱氢酶基因得到。

其中，葡萄糖脱氢酶GDH来源于枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis168，参见“枯草芽孢杆菌168产生的一种新磷脂类抗生素bacilysocin[J]；国外医药，抗生素分册；2002年04期)，烯键还原酶HP3来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis，ATCC 20615)。