[发明专利]一种大肠杆菌基因工程菌、构建方法以及全细胞催化生产(R)-香茅醛的方法

权利要求书

1.一种可用于催化生产(R)-香茅醛的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：以大肠杆菌E.coli BL21(DE3) 为出发菌株，利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，实现其基因组上的醇脱氢酶基因adhE的敲除，获得大肠杆菌BL21(DE3) ΔadhE；

S2：以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，PCR获得葡萄糖脱氢酶GDH基因片段，使用限制性内切酶双酶切葡萄糖脱氢酶GDH基因的DNA片段和pET28a质粒，连接，获得葡萄糖脱氢酶GDH表达载体；

S3：以热带假丝酵母ATCC 20615基因组DNA为模板，PCR获得烯键还原酶HP3基因片段，使用限制性内切酶双酶切烯键还原酶HP3基因的DNA片段和pET21a质粒，连接，获得烯键还原酶HP3表达载体；

S4：将步骤S2获得的葡萄糖脱氢酶GDH表达载体及步骤S3获得的烯键还原酶HP3表达载体共同转入步骤S1获得的敲除adhE基因的大肠杆菌BL21(DE3) ΔadhE，得到大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3) ΔadhE/pET21a-HP3/pET28a-GDH；

其中，所述醇脱氢酶基因adhE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶GDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述烯键还原酶HP3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤S1包括：

S11：以携带有醇脱氢酶adhE的大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，并设计醇脱氢酶编码基因adhE上下游同源臂的引物，进行聚合酶链式反应，得到adhE线性同源重组片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，胶回收纯化；

S12：选择醇脱氢酶编码基因adhE上一段长度为20bp的序列设计SgRNA-adhE的引物，以SgRNA表达质粒为模板，进行PCR，得到SgRNA-adhE线性化质粒片段，胶回收纯化线性化质粒片段，经DNA连接酶连接后得到连接反应产物，将连接产物转入E. coli DH5α感受态细胞，通过平板筛选得到重组质粒SgRNA-adhE；

S13：将表达Cas9蛋白的载体质粒pCas9转入原始菌中，筛选出带有pCas9质粒的重组菌，培养重组菌，经L-阿拉伯糖诱导后制备成电转感受态细胞；

S14：将步骤S11得到的所述adhE线性同源重组片段及步骤S12得到的所述重组质粒SgRNA-adhE一起电转化进入步骤S13中的电转感受态细胞中，进行基因编辑，得到突变的大肠杆菌；

S15：去除步骤S14得到的突变的大肠杆菌中的载体质粒，得到E.coli BL21(DE3) ΔadhE。

2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S11中使用的上下游同源臂引物adhE-Up-F、adhE-Up-R、adhE-Up-Down-F和adhE-Down-R的序列如SEQ ID NO.5~8所示。

3. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S12中使用的SgRNA-adhE引物Sg-F和adhE-Sg-R的序列如SEQ ID NO.9~10所示。

4. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中使用的引物GDH-F和GDH-R的序列如SEQ ID NO.11~12所示，步骤S4中使用的引物HP3-F和HP3-R的序列如SEQ IDNO.13~14所示。

5.一种根据权利要求1~4中任意一项所述的方法构建得到的可用于催化生产(R)-香茅醛的大肠杆菌基因工程菌。