[发明专利]一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法

说明书

本发明公开了一种用于区分人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，HRSV)A型和B型的多重反转录实时荧光定量PCR(RT‑qPCR)试剂盒、专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管三色荧光多重RT‑qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分人呼吸道合胞病毒A/B型。本发明的HRSV分型(A/B型)检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种用于人呼吸道合胞病毒分型(A/B型)检测的多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法。

背景技术

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，HRSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原体之一，在一些地区，2岁以下儿童至少发生过一次HRSV感染。近年来，大量研究发现HRSV也可以引起成年人、老年人以及免疫力低下患者感染。随着HRSV的流行，多种基因型相继出现，并呈现交替流行以及共流行的趋势，根据抗原不同，大致可以分为A型和B型两大亚型，不同亚型的主要结构蛋白存在明显差异，也导致不同亚型造成的疾病程度有所差异，因此如果能够较好地区分HRSV型别则能够对病毒的溯源和治疗以及疫苗的研发提供较好的指导意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一种用于区分HRSVA/B型的多重反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)试剂盒、其专用的引物探针组合物及其使用方法，该试剂盒采用单管多重RT-qPCR方法针对人呼吸道样本检测并区分HRSV型别。本发明的HRSV分型(A/B型)检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好，能通过对人类RNA内参B2M基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量监控，并利用dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的假阳性结果出现。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明所提供的一种用于HRSV分型(A/B型)检测的多重RT-qPCR试剂盒包含RT-qPCR反应液(包含引物探针组合物)、RT-qPCR酶液、阳性对照以及阴性对照。其中RT-qPCR反应液包括反应所需的dNTPs、dUTP、Mg²⁺、缓冲液(表1)和引物探针组合物(表2和表3)。

表1 RT-qPCR反应液试剂组成(50人份)

其中引物探针组合物包含用于检测HRSV A型G基因、HRSV B型G基因以及人类RNA内参B2M基因的引物和探针，引物和探针序列信息如表2所示，引物和探针组成如表3所示。由上述正反向引物和探针序列的衍生序列也属于本发明内容，所述衍生序列是指在SEQ IDNO：1～9的基础上，在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。

HRSV基因组全长约为15.2kb，共包含10个基因，分别为NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L，其中G蛋白和F蛋白是HRSV重要的膜表面糖蛋白。G蛋白主要包含胞浆区(aa1-aa37)、跨膜区(aa38-aa67)以及胞外区(aa68-aa298)，胞外区域有2个黏蛋白区和1个中心保守区。本发明依据G蛋白黏蛋白区的第二高可变区核苷酸序列对HRSV进行A/B分型。

人β-2微球蛋白(Beta-2-microglobulin，B2M)是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，是细胞表面人白细胞抗原的β链部分，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、初乳以及唾液中，且蛋白表达和细胞膜释放量相当恒定，非常适合作为呼吸道常见病毒检测中监控样本提取和PCR扩增的内参基因。

表2 RT-qPCR反应液中所包含的引物和探针序列信息