[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法

说明书

本发明属于生物工程领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法，包括靶向小鼠Ahnak2基因的sgRNA载体构建、sgRNA的体外转录、F0代小鼠获取及鉴定、F1代杂合小鼠获取及鉴定、纯合后代的获取等过程构建Ahnak2基因敲除动物模型，所构建的动物模型，解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，通过筛选更为高效的靶向小鼠Ahnak2基因的sgRNA载体，并对进一步降低脱靶率，提高小鼠后代阳性率及模型构建的成功率，经过6代纯合自交依然能够获得纯合后代，使得本发明方法构建的动物模型具有良好的稳定性，在心脏病、结直肠癌、子宫癌等肿瘤机理研究及药物开发领域具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及利用基因修饰技术制作基因敲出动物模型的领域，更具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA介导Cas蛋白对目的基因进行靶向修饰的技术。经过研究者改造过的TypeⅡCRISPR/Cas9系统自2013年成功敲除哺乳动物细胞后，现在已经被应用于多种模式生物的基因敲除。CRISPR/Cas9系统载体构建简单快速，易操作，省时省力周期短，且几乎对所有物种都适用。CRISPR/Cas9和TALEN(Transcription Activator-like Effector Nucleases)的作用都是实现染色体上特定位点的双链断裂，然后引发自主损伤修复，修复会引发插入或缺失，从而造成基因序列永久的缺失，即基因敲除。针对每个基因，CRISPER/Cas9只需要构建一个sgRNA(singleguideRNA)，而且效率都很高，序列选择限制较小，只需要基因组上出现GG就可以。与zinc-finger nuclease(ZFN)和TALEN相比，CRISPER/Cas9引起的脱靶效应较高，但是使用成对sgRNA/Cas9-D10A截短的sgRNA或者FoKI-dCas9可以极大的降低脱靶效应。目前，CRISPER/Cas9主要应用于基因定点突变(插入或缺失)、基因定点敲除、两位点同时突变、小片段的缺失、编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除。

Ahnakβ位于11q12.2，长1108bp，由6个外显子和5个内含子组成，其中开放阅读框(ORF)长450bp(301-750nt)，编码含有149个氨基酸，蛋白质大小约为16.0KD。它是Ahnak的第二个转录剪接体。第一个转录剪接体Ahnakα的cDNA为18815个碱基，编码一个680KD的巨型蛋白。通过BLAST比对，发明人所在研究团队首次发现Ahnakα与Ahnakβ的N端是一样的，但是Ahnakβ的C端与α完全不一样。因为已知Ahnakα具有控制心肌收缩的作用，提示Ahnakβ可能与心脏发育相关。研究表明Ahnak2基因在小鼠成体中心脏和肠的表达最强，其次在子宫的表达较强，在脾脏和肾有微弱的表达。因此，基于该前期研究成果构建Ahnak2基因敲除的动物模型，对于心脏病、结直肠癌、子宫癌的发病机理的研究及药物开发具有极为重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、高效且成功率高的基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术的Ahnak2基因敲除动物模型的构建方法，包括以下步骤：

S1：靶向小鼠Ahnak2基因的sgRNA载体构建

以Ahnak2内含子位置作为敲除区域，根据靶基因Ahnak2设计一对相应的sgRNA序列，sgRNA序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

S2：sgRNA的体外转录

将步骤S1中合成的一对sgRNA和cas9 mRNA进行体外转录；