[发明专利]一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法。本发明采用斑马鱼Nanos2蛋白质作为免疫原免疫动物制备得到，制备得到的抗体通过特异性识别生殖干细胞特异性分子标记蛋白质Nanos2，能够用于免疫组织化学及免疫荧光检测，特异性标记和检测斑马鱼精巢和卵巢中的生殖干细胞，填补了利用抗体特异性检测鱼类生殖干细胞应用的空白。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法。

背景技术

鱼类生殖干细胞的鉴定和评估是以生殖细胞操作为基础的鱼类育种工作的基础。为了能方便地鉴定鱼类成体性腺中的生殖干细胞以及有效评估生殖干细胞自我更新和维持状态，需要对鱼类性腺中的生殖干细胞进行鉴定和评估。目前对鱼类生殖干细胞的鉴定方法仅局限在形态学鉴定及基因检测上，尚未有采用抗体进行检测的相关报道。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法，制备得到的多克隆抗体可以用于鱼类性腺中生殖干细胞的鉴定，具体的制备方法包括以下步骤：收集纯化斑马鱼Nanos2蛋白质，用纯化后的Nanos2蛋白质免疫动物得到含有多克隆抗体的血清，纯化血清即得。

其中，斑马鱼Nanos2多克隆抗体的抗原蛋白质为现有技术所公开，记载于NCBI数据库中，其登录号为：XP_009300191.1，斑马鱼Nanos2蛋白质的氨基酸序列如下所示：MMQSESQQSVPTADGCFLMWRDYMDLRRTLSQLLLEHRDEERAAVSVVPAEGFIRTGSSSSVSGSSCTLSSSSQDLRSPRDSCGFCRQNGETAQIYRSHRLKARDGRVLCPILRSYVCPLCSATGDRAHTRYYCPRRNITKKNSSF，参见SEQ IDNO:1。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼Nanos2蛋白质的收集纯化包括以下步骤：将斑马鱼Nanos2的蛋白质编码区克隆到表达载体中，将重组表达载体转化到大肠杆菌中进行表达，纯化表达产物即得。

作为本发明的一种实施方式，所述表达载体为PET-28a表达载体。

作为本发明的一种实施方式，重组表达载体的制备包括以下步骤：人工合成大肠杆菌密码子优化后的含有酶切位点的斑马鱼Nanos2蛋白质编码序列；酶切上述合成序列和pET-28a表达载体；用连接酶将酶切后的合成序列和pET-28a连接即得。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼Nanos2蛋白质的表达包括以下步骤：选取转化成功单克隆培养至菌体OD₆₀₀为0.6~0.8，加入IPTG诱导表达，培养3~5h后离心，收集菌体并破碎，上清沉淀分别制样并SDS-PAGE分析。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼Nanos2蛋白质的纯化采用Ni柱亲和层析纯化。

作为本发明的一种实施方式，斑马鱼Nanos2蛋白质纯化时所用的平衡液为Tris-Triton-NaCl缓冲液，pH8.0；清洗缓冲液为含有20mM咪唑的Tris-Triton-NaCl缓冲液，pH8.0；洗脱缓冲液为含有500mM咪唑的Tris-Triton-NaCl缓冲液。

作为本发明的一种实施方式，多克隆抗体血清的制备包括以下步骤：选择新西兰白兔，预养并标记；抽取抗原，首次免疫抗原浓度为1mg/ml，兔子为0.5ml/只，二-四次免疫抗原浓度减半，剂量不变；抽取佐剂，佐剂和抗原按1:1体积比抽取，首次免疫采用完全佐剂，二-四次免疫采用不完全佐剂，抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器，进行完全乳化；皮下注射免疫兔子，首次免疫后第14天进行二次免疫，二次免疫到三次免疫间隔时间为7天，兔子第三次免疫后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后补加一次免疫，免疫完7天后采集全血。

本发明的目的之二还在于保护上述方法制备得到的多克隆抗体。