[发明专利]一种可标记鱼类生殖干细胞的多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，所述斑马鱼Nanos2多克隆抗体用于鱼类性腺中生殖干细胞的鉴定。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，所述多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

收集纯化斑马鱼Nanos2蛋白质，用纯化后的Nanos2蛋白质免疫动物得到含有多克隆抗体的血清，纯化血清即得。

3.根据权利要求2所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，斑马鱼Nanos2蛋白质的收集纯化包括以下步骤：将斑马鱼Nanos2的蛋白质编码区基因克隆到表达载体中，将重组表达载体转化到大肠杆菌中进行表达，纯化表达产物即得。

4.根据权利要求3所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，所述表达载体为PET-28a表达载体。

5.根据权利要求3所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，重组表达载体的制备包括以下步骤：

人工合成大肠杆菌密码子优化后的含有酶切位点的斑马鱼Nanos2蛋白质编码序列；

酶切上述合成序列和pET-28a表达载体；

用连接酶将酶切后的合成序列和pET-28a连接即得。

6.根据权利要求3所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，斑马鱼Nanos2蛋白质的表达包括以下步骤：选取转化成功单克隆培养至菌体OD₆₀₀为0.6~0.8，加入IPTG诱导表达，培养3~5h后离心，收集菌体并破碎，上清沉淀分别制样并SDS-PAGE分析。

7.根据权利要求3所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，斑马鱼Nanos2蛋白质的纯化采用Ni柱亲和层析纯化。

8.根据权利要求7所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，斑马鱼Nanos2蛋白质纯化时所用的平衡液为Tris-Triton-NaCl缓冲液，pH8.0；清洗缓冲液为含有20mM咪唑的Tris-Triton-NaCl缓冲液，pH8.0；洗脱缓冲液为含有500mM咪唑的Tris-Triton-NaCl缓冲液。

9.根据权利要求2所述的斑马鱼Nanos2多克隆抗体在鱼类生殖干细胞鉴定和评估研究中的应用，其特征在于，多克隆抗体血清的制备包括以下步骤：

选择新西兰白兔，预养并标记；

抽取抗原，首次免疫抗原浓度为1mg/ml，兔子为0.5ml/只，二-四次免疫抗原浓度减半，剂量不变；

抽取佐剂，佐剂和抗原按1:1体积比抽取，首次免疫采用完全佐剂，二-四次免疫采用不完全佐剂，抽取时，佐剂要充分混合均匀后再抽入注射器，进行完全乳化；

皮下注射免疫兔子，首次免疫后第14天进行二次免疫，二次免疫到三次免疫间隔时间为7天，兔子第三次免疫后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后补加一次免疫，免疫完7天后采集全血。