[发明专利]一种UCST型温敏性聚合物固定化酶的方法

说明书

本发明公开了一种UCST型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体为：首先，将聚丙烯酸类聚合物和引发剂用去离子水溶解，转移到三口烧瓶中，缓慢加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，进行磁力搅拌反应，离心，用丙酮洗涤，烘干，得到固体产物；再将固体产物用缓冲液进行溶解，加入酶，进行恒温震荡反应，再加入胶原及其水解物，恒温震荡，离心，清洗，所得到的沉淀物即为固定酶载体，将固定酶载体置于冰箱冷藏，即可完成固定酶载体的制备。该UCST型温敏性聚合物‑固定化酶体系，能实现液相催化底物，解决传统固定化酶固相催化底物，催化效率低的缺陷。

技术领域

本发明属于固定酶技术领域，具体涉及一种UCST型温敏性聚合物固定化酶的方法。

背景技术

酶是一类具有高效催化能力的生物活性大分子，广泛应用于工业生产、医药卫生、环境保护等领域。然而大多数情况下酶的特异性催化反应是在水溶液中进行的，反应后残留于溶液中，分离回收困难，无法重复多次使用，增加了生产成本，这已成为其工业应用的主要限制。将酶固定在固体载体上，是实现酶回收利用的有效方法。然而固定的酶载体催化底物时，酶与底物接触位点减少，催化效率降低，这大大限制了其使用。

目前，温敏性聚合物作为一种固液相可逆转变的新型材料，可以通过调节温度，在液相催化底物，固相分离回收利用，从而解决固体酶制剂催化底物效率低的问题。温度敏感性材料中研究最为广泛 (UCST)型聚(丙烯酸-co-丙烯酰胺)类化合物，其高临界溶解温度一般在15℃左右，它能在高温液相高效催化底物，低温固相快速回收利用。但是以丙烯酰胺单体制备UCST体系所存在一定的安全隐患，聚丙烯酰胺具有一定的毒性，且丙烯酰胺系列温敏聚合物在降解 /水解过程中还会产生对身体有害的胺类小分子化合物，导致其在生物技术领域的应用过程中受到极大制约。

发明内容

本发明的目的在于提供一种UCST型温敏性聚合物固定化酶的方法，能大大提高酶的催化活性和稳定性。

本发明所采用的技术方案是，一种UCST型温敏性聚合物固定化酶的方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，将聚丙烯酸类聚合物和引发剂用去离子水溶解，转移到三口烧瓶中，缓慢加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，摇匀后通氮气鼓泡半小时后转入单口烧瓶中，氮气保护下抽真空，进行磁力搅拌反应，待反应结束后，离心去除上层清液，用丙酮重复洗涤，烘干，得到白色的固体产物；

步骤2，将固体产物用缓冲液进行溶解，之后加入酶，进行恒温震荡反应，再加入胶原及其水解物，恒温震荡30min，离心，用去离子水清洗，所得到的沉淀物即为固定酶载体，将固定酶载体置于冰箱冷藏，即可完成固定酶载体的制备。

本发明的特点还在于，

步骤1中，聚丙烯酸类聚合物、甲基丙烯酸缩水甘油酯、引发剂和去离子水的摩尔比为1-12：0.01-0.024：0.01-0.012：20-480。

步骤1中，反应温度为50℃-100℃，反应时间为4-24h；烘干温度为0-40℃，烘干时间为10-12h。

步骤1中，引发剂为过硫酸铵、过硫酸钾或者过硫酸钠；聚丙烯酸类聚合物的结构简式为(C₃O₂H₃-R)_n，其中，R为甲基、乙基、异丁基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基中的任意一种。

步骤2中，固体产物、缓冲液、酶、胶原及其水解物的摩尔比为 0.1-1：1-10：10-40：0.1-1。

步骤2中，缓冲液为乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的任意一种；胶原及其水解物为胶原、明胶或者胶原多肽；酶为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、漆酶、木聚糖酶中的任意一种或者多种。