[发明专利]腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1、编码基因及应用

说明书

本发明公开了一种本发明涉及一种腈水合酶突变体，具体涉及一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA‑K2H1及其编码基因，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该腈水合酶赖氨酸突变体HBA‑K2H1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。所述突变体HBA‑K2H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其最适pH为8.5，最适温度为35℃。与野生酶HBA相比，突变腈水合酶HBA‑K2H1的碱性活力得到了改良，可应用于生物催化生产丙烯酰胺、烟酰胺及其它高附加值的酰胺类化合物，化工纤维表面改性和碱性污水处理等生物技术领域。

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水合酶突变体，具体涉及一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1及其编码基因，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

(二)背景技术

腈水合酶能够通过水和作用将各种有机腈化合物的氰基转换成酰胺基，与化学水解法相比生物转化法具有效率高、条件温和、环境污染小、并能在无额外引入保护/修饰基团的情况下实现化学、区域和对映体选择性等优点。为了在工业上利用腈水合酶催化生产丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺等酰胺类化合物，降低该酶的制造成本在酰胺化合物的制造成本中所占的比例尤为重要。具体而言，必须提高单位重量酶制备物中腈水合酶的含量。随着生物技术的迅速发展，用基因工程技术手段来构建具有腈水合酶活性的基因重组菌株可以用来克服上述的缺点。此外，利用基因重组菌来表达腈水合酶可以定向表达腈水合酶，以避免催化反应过程中副反应的发生，确保酰胺类目标产物在产生的过程中不被部分水解，从而提高酰胺产品的产量和质量。

腈水合酶的基本结构单位是由α亚基和β亚基结合而成的二聚体，结构单位进一步结合形成4～12聚体(根据来源的物种不同而不同)而发挥活性。腈水合酶在表达翻译的过程中需要摄入金属离子(铁离子或钴离子)，并伴随金属离子配位发生的现象，其活性中心区域的2个半胱氨酸残基在翻译后发生氧化修饰。腈水合酶的翻译后成熟的过程需要特定的分子伴侣来协助腈水合酶摄入金属离子。但是，还没有任何发明公开关于在没有分子伴侣协助的情况下，钴型腈水合酶能主动完成翻译后修饰的实例，同时也没有任何发明公开能人工调节腈水合酶翻译后自修饰效率的具体方法。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种翻译后自修饰效率改良的钴型腈水合酶突变体HBA-K2H1，含有该突变体编码基因的质粒及重组菌，以及该腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1序列如下：

本发明还涉及编码所述的腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1的基因(hba-k2h1)。具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述突变体HBA-K2H1的最适pH为8.5，最适温度为35℃，比活力为684.5±10.2 U/mg，钴离子摄入率为0.71±0.02。

SEQ ID NO.2序列如下：

本发明还涉及含有编码所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1的基因的质粒，以及利用该质粒获得的含有编码所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1的基因的重组菌。

本发明还涉及所述腈水合酶赖氨酸突变体HBA-K2H1在催化有机腈化合物制备酰胺化合物中的应用。

具体的，所述催化反应在35～45℃、pH8.0～9.0条件下进行。

优选的，所述有机腈化合物为3-氰基吡啶，所述酰胺化合物为3-吡啶甲酰胺。