[发明专利]一种牛源致病性蜡样芽孢杆菌间接ELISA检测试剂盒

说明书

本发明涉及微生物检测技术，即一种牛源致病性蜡样芽孢杆菌间接ELISA检测试剂盒。其特点是：所述间接ELISA检测试剂盒以牛源致病性蜡样芽孢杆菌菌悬液为包被抗原。有益效果：所制备的检测试剂盒适用于牛源致病性蜡样芽孢杆菌的检测，且具有检测特异性强，灵敏度高，检测过程快，操作方便等特点，为预防牛的蜡样芽孢杆菌感染提供了有效的技术与工具。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术，具体涉及一种牛源致病性蜡样芽孢杆菌间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus.Frankland）属芽孢杆菌科，蜡样芽孢杆菌属，该菌与苏云金芽孢杆菌及炭疽杆菌等生物学特性相近，广泛存在于自然环境及食物中。可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境。部分蜡样芽孢杆菌可作为促植物生长剂及动物饲料内的微生物添加剂。该细菌为条件致病菌，临床多使人或动物发生呕吐或腹泻，为常见的食源性致病菌之一。但在此之前并未查到该细菌对牛感染致死的相关报道。2018年内蒙古通辽市多地出现牛猝死病例，我们对其中的两头病死牛进行炭疽杆菌病、口蹄疫病毒病等传染性疾病的排查后，对其血液进行细菌培养并发现有菌落生长。对生长细菌进行分离鉴定，最后确定其为蜡样芽孢杆菌。为了对该牛源致病性蜡样芽孢杆菌引起的疾病进行快速、有效检测，临床上必须建立灵敏、特异、高效的蜡样芽孢杆菌血清学检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛源致病性蜡样芽孢杆菌间接 ELISA检测试剂盒。

上述目的是由以下技术方案实现的：

提供一种牛源致病性蜡样芽孢杆菌间接ELISA检测试剂盒，所述间接ELISA检测试剂盒以牛源致病性蜡样芽孢杆菌菌悬液为包被抗原。

所述牛源致病性蜡样芽孢杆菌菌悬液由如下方法制备而成：

将牛源致病性蜡样芽孢杆菌划线接种于普通琼脂培养基上，37℃过夜培养，挑取单个菌落接种到LB液体培养基，37℃培养12-24h后；将培养得到的蜡样芽孢杆菌培养物离心，收集菌体，洗涤，用碳酸盐缓冲液重悬菌体，制成蜡样芽孢杆菌菌悬液。

所述普通琼脂培养基由以下重量的原料及方法制成：

蛋白胨10g、琼脂14g、氯化钠5g、牛肉浸出粉3g、蒸馏水1000ml，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。

所述LB液体培养基原料及制备方法为:蛋白胨10g、酵母浸粉5g、氯化钠5g、葡萄糖2-3g、蒸馏水1000ml，调PH至7.2-7.4，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。

所述间接ELISA检测试剂盒还包括：酶标板、封闭液、牛源致病性蜡样芽孢杆菌阳性血清、牛源致病性蜡样芽孢杆菌阴性血清、酶标二抗、底物显色液和终止液。

所述封闭液为5％脱脂奶粉。

所述酶标二抗为HRP-羊抗牛IgG。

上述间接ELISA检测试剂盒检测蜡样芽孢杆菌抗体的方法，包括以下步骤：

1.用抗原包被液将蜡样芽孢杆菌菌悬液1：60稀释，包被酶标板，4℃包被过夜；

2.取出酶标板，用PBST溶液洗涤，加入封闭液，37℃封闭2h；

3.分别加入1：200稀释后的牛源致病性蜡样芽孢杆菌阳性血清、牛源致病性蜡样芽孢杆菌阴性血清和待检血清；37℃孵育1h；

4.加入按1:8000稀释的酶标二抗，37℃孵育1h；

5.加入底物显色液，37℃避光反应15min；

6.加入终止液进行终止反应，在450nm处读取吸光值，对检测结果进行判定，若待测样品的OD_450nm 0.525，判定为阳性，反之则为阴性。