[发明专利]一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用，属于生物发酵技术领域，本发明通过敲除了编码purR的基因，敲低了编码glnR和tnrA的基因，并且采用过表达了来源于玻璃颤菌的血红蛋白，解除发酵过程中的溶氧限制，降低发酵过程中的能源消耗，提高核黄素产量；采用本发明构建的工程菌株RF1‑aPaGaTgV的核黄素产量在摇瓶阶段提高了50.78％，达到2.51g/L。在5‑L发酵水平，采用本发明构建的RF1‑aPaGaTgV的核黄素的最高产量提高了45.51％，达到10.71g/L。

技术领域

本发明涉及一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

核黄素(维生素B2)是维持人体正常生理代谢的营养元素，只能通过饮食获得。自然界中只有微生物和植物细胞具有合成核黄素的能力，而哺乳动物细胞缺乏相应的合成途径。核黄素在我们的日常生活中有着广泛的应用，可以作为食品添加剂、药品、保健品和化妆品原料等。近年来，微生物发酵生产核黄素在工业上已完全取代化学合成。发酵产生核黄素的微生物主要有Bacillus subtilis和Ashbya gossypii。此外，Candida flareri、E.coli和Lactobacillus plantarum也被用作合成核黄素底盘细胞，但这些菌株在工业生产中很少见到。

微生物细胞具有相似的核黄素合成途径，有两个重要的核黄素合成前体：核酮糖-5磷酸来自戊糖磷酸途径，鸟嘌呤(GTP)来自嘌呤途径。然后由rib基因编码的酶通过7步反应将两种前体转化为核黄素。枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌，是目前最具竞争力的核黄素生产菌株，已广泛用于工业核黄素生产。使用枯草芽孢杆菌生产核黄素的一个明显优势是，它被美国食品和药物管理局认定为GRAS(公认安全)菌株，并长期用于嘌呤核苷、肌苷和生产。枯草芽孢杆菌不能天然过度生产核黄素，是经过多轮育种和选择后获得这一优良性状。随后，通过启动子替换、基因敲除和外源表达等基因工程和代谢工程策略进一步提高工程菌株的产量。例如，基因purF、purM、purN、purH和purD过表达受强启动子P₄₃控制，导致工程菌株核黄素产量增加25％。此外，过表达突变体PurF显著增加核黄素前体鸟嘌呤的合成，并使核黄素的产量增加3倍。虽然目前的代谢工程方法已经大大提高了核黄素的产量，但要继续提高产量仍存在各种瓶颈。

而目前工业上采用生物法制备核黄素时，主要是采用基因工程菌进行发酵培养生产核黄素，并且，需要采用不断供氧的方式进行发酵，原因如下：大多数需氧生物代谢过程都以氧为电子受体。溶解氧是好氧微生物发酵过程中的一个重要参数，通常影响细胞的生长和代谢产物的合成。在发酵后期，溶解氧是限制好氧微生物生长和合成的主要因素，特别是高密度发酵。当外界氧气有限时，微生物可以利用另一种电子受体，即硝酸盐或亚硝酸盐，通过厌氧呼吸生长。缺氧导致低效的NADH和NADPH氧化，这是三羧酸(TCA)循环中产生ATP和低代谢流量的必要反应。能量转换效率低下会直接影响细胞增殖，导致细胞生长缓慢。为了克服这个问题，高密度发酵系统使用纯氧来补充或替代供气，为生长中的细菌提供足够的氧气。纯供氧将使液体培养中的氧传输率不再是一个限制因素。但这也对工业发酵提出了更高的要求，增加了消费成本。

例如公开号为CN102816823B的中国发明专利中公开了一种利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法；采用多阶段控制溶氧的策略提高核黄素的产量，但该方法在工业应用中操作繁琐，不易掌握调整转速的时间节点，对工业发酵的操作提出更高的要求，且无法进一步突破溶氧的限制。

尽管生物技术应用有许多优点，但对氧气的巨大需求已成为大规模生产的瓶颈。核黄素的合成过程需要大量的溶解氧，而溶解氧的水平是限制核黄素生产的重要因素。研究表明，溶解氧不足是核黄素合成的限制因素之一，溶解氧不足导致核黄素合成相关基因表达水平显著差异。因此，缓解溶氧对核黄素代谢的限制是提高核黄素产量的有效策略；而如何能够得到一株能够高效生产核黄素并且不需要采用高成本的供氧体系的基因工程菌成为研究的难点。

发明内容

技术问题：