[发明专利]一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法及应用

权利要求书

1.一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

分别制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体和抗水牛乳蛋白特异性单克隆抗体，分别记作：Anti-CC和Anti-BC；

制备抗牛乳蛋白和抗水牛乳蛋白共同位点的单克隆抗体，记作：Anti-total；

将抗牛乳蛋白和抗水牛乳蛋白共同位点的单克隆抗体标记胶体金获得抗体胶体金标记物；

通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡；

所述制备抗牛乳蛋白特异性单克隆抗体，具体包括：

(1)通过软件设计得到牛乳κ-酪蛋白半抗原的氨基酸序列为：ESPPEINTVQVTSAV(SEQID NO：1)；

(2)将所述牛乳κ-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗牛乳κ-酪蛋白单克隆抗体，该抗体识别位点为抗牛乳κ-酪蛋白的ESPPEINTVQVTSAV氨基酸序列；

所述制备抗水牛乳蛋白特异性单克隆抗体，具体包括：

(1)通过软件设计得到水牛乳κ-酪蛋白半抗原的氨基酸序列为：ESVPETNTAQVTSTVV(SEQ ID NO：2)；

(2)将所述水牛乳κ-酪蛋白半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗水牛乳κ-酪蛋白单克隆抗体，该抗体识别位点为抗水牛乳κ-酪蛋白的ESVPETNTAQVTSTVV氨基酸序列；

所述制备抗牛乳蛋白和抗水牛乳蛋白共同位点的单克隆抗体，具体包括：

(1)通过软件设计得到牛乳κ-酪蛋白和水牛乳κ-酪蛋白共同位点的半抗原氨基酸序列：INNQFLPYPYYAKP(SEQ ID NO：3)；

(2)将所述牛乳κ-酪蛋白和水牛乳κ-酪蛋白共同位点的半抗原与苯甲酸预活化的多聚赖氨酸偶联得到免疫原；再将获得的免疫原通过杂交瘤方法制备抗牛乳κ-酪蛋白和抗水牛乳κ-酪蛋白共同位点的单克隆抗体，该抗体识别位点为抗牛乳κ-酪蛋白和抗水牛乳κ-酪蛋白共同位点的INNQFLPYPYYAKP氨基酸序列；

所述通过抗体胶体金标记物制备二联检测卡，具体包括：

(1)将Anti-total和胶体金制备成抗体胶体金标记物，将抗体胶体金标记物用PBS溶液稀释至8～9μg/mL，在玻璃纤维素膜上均匀铺开，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫；

(2)取还原剂预处理硝酸纤维素膜的反应区，再使用戊二醛预处理硝酸纤维素膜的反应区，再将Anti-CC和Anti-BC分别包被于反应区作为检测线，得到反应垫；所述的还原剂为0.01g/mL的硫氢化钠溶液；还包括将正常羊抗鼠IgG包被于反应区作为质控线；

(3)将样品垫浸泡于封闭液中进行封闭处理，之后于37℃真空干燥并封装；

(4)依次将样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫粘附于PVC背衬上，即得。

2.一种牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡，其特征在于：是通过权利要求1所述的制备方法获得，所述二联检测卡包括PVC背衬，所述PVC背衬上依次设置有样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫，并且所述二联检测卡的样品垫上设置有样品孔；所述反应垫上设有检测线；所述反应垫上还设有质控线。

3.权利要求1所述的制备方法获得的牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡或者权利要求2所述的牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡的应用方法，包括：

(1)将液态乳或乳粉用蒸馏水制成样品检测溶液；

(2)取出牛乳蛋白和水牛乳蛋白二联检测卡，将样品检测溶液滴入样品垫的样品孔中，5～10min观察检测结果。