[发明专利]基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用

说明书

本发明涉及基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用。该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1（50mM氯化钠，10mM Tris‑盐酸，10mM氯化镁，100ug/ml牛血清白蛋白，pH7.9/25摄氏度）、1份1uM引导序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物或转基因植物的质粒裂解液、1份反应标记物及13份水。本发明为转基因植物的核酸检测提供了新的技术和方法，必将推进基因编辑检测技术在植物核酸检测上的应用研究，具有重要的现实意义。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体涉及基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法、反应体系及其应用。

背景技术

2017-2019年以Cas12a(CRISPR DNA内切酶)为基础的DNA检测技术DETECTR，以Cas13a(CRISPR RNA内切酶)为基础的SHERLOCK RNA检测技术的出现，开拓了在核酸基础上利用基因编辑技术作为高通量、快速、准确、灵敏、易用检测技术的先河，基因编辑检测技术建立在高效核酸检测的基础上，与传统的单克隆抗体蛋白检测技术相比，以无可比拟的优势让多样的植物病毒和转基因植物的高效、快速监管成为可能。目前，以Cas13a为基础的体外核酸检测技术已初步在医学和植物检测上运用，显示高度敏感性、准确性；以Cas12a为基础的体外核酸检测技术已初步在医学上运用，但还没有在植物基因检测上应用；无论是CRISPR DNA内切酶还是CRISPR RNA内切酶都还没有在植物转基因成分检测上的应用报道。CRISPR DNA内切酶报告检测技术由于检测对象是DNA序列，反应体系具有更高的稳定性，在植物基因检测上更容易与传统的PCR、等温扩增等检测技术衔接起来。

发明内容

为充分利用CRISPR DNA内切酶检测技术的优势，填补以Cas12a为基础的体外核酸检测技术在植物基因检测上的空白，本发明利用Cas12a酶开展转基因植物DNA成分的检测，为转基因植物的检测提供新的技术和方法。

具体的，本发明提供了一种基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测反应体系，该反应体系用于植物转基因成分的检测，以体积份数计，每份反应体系各包括如下体积份的各成分：2份10xNE缓冲液2.1、1份1uM引导及折叠序列、1份1uM Lba Cas12a、1份RNA酶抑制剂、1份转基因植物DNA提取物的RPA等温扩增产物、1份反应标记物及13份水。

其中，该反应体系对应的植物转基因成分为CaMV35S启动子、HPT基因、Bar基因或NPTⅡ基因，其各自对应的引导及折叠序列如下：

其中，加粗的为引导序列。

其中，该反应体系用于植物转基因成分的酶标仪检测、定量PCR仪检测以及试纸条显色检测等。

其中，酶标仪检测的反应标记物选自S2或S4，标记方法：两端分别带有FAM和BHQ1基团的含TAT碱基序列单链DNA分子，S2为5`6-FAM-TTAT-3`BHQ1，S4为5`6-FAM-TAT-3`BHQ1；

试纸条检测的反应标记物选自S3，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TAT-Biotin-3；

定量PCR仪检测的反应标记物选自S5，标记方法：两端分别带有FAM和Biotin基团的含TAT碱基序列单链DNA分子5`6-FAM-TTATT-3`BHQ1。

本发明另外提供一种基于CRISPR Cas酶基因编辑技术的转基因成分检测方法，包括如下步骤：

步骤S1：通过CTAB法提取植物DNA；

步骤S2：制备DNA的RPA等温扩增引物；