[发明专利]一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：重悬液、裂解液、中和液、清洗液、洗脱液；所述重悬液的配方如下：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml；所述裂解液的配方如下：氢氧化钾或氢氧化钠100mM‑2M，十二烷基苯磺酸钠或十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠1g/100ml。所述中和液的配方如下：盐酸胍1M‑6M，醋酸钾或醋酸钠100mM‑1M，醋酸调节pH至2‑8。本发明可以克服现有方法中沉淀复合物较轻、沉淀不完全或去除过程需要高速离心机、对实验室设备要求较高、花费的时间也较长的问题，具有广阔的市场应用前景。

技术领域

本发明涉属于实验试剂技术领域，具体涉及一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒及其应用。

背景技术

质粒是DNA重组的重要载体和工具，分离纯化质粒是现代分子生物技术必不可少的手段。现有质粒的分离使用最多也最为经典的方法仍为碱裂解法，具体包括以下步骤：收集菌体、重悬、碱裂解、中性化、长时间离心除杂质、DNA结合、洗净、洗脱等。这一方法抽提纯化质粒的时间大约需要30min，主要耗时在中性化后细胞碎片的离心去除步骤，大约需要耗时10-15min，且当离心时间和离心力不足时细胞碎片因悬浮无法有效去除，将对抽提质粒的质量造成很大的影响，如影响酶切、杂蛋白含量超标等，现市面上以碱裂解法原理的质粒小抽和大抽试剂多为钾盐、胍盐和SDS形成沉淀复合物，沉淀去除细胞碎片，由于形成的沉淀复合物较轻，去除过程需要高速离心机，对实验室设备要求较高，花费的时间也较长，所花成本也较高，不太适合大量样品的抽提，也限制了其自动化的进程。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种快速高效纯化质粒的试剂盒，以解决质粒抽提纯化过程中细胞碎片离心时间长、细胞碎片去除效果差的问题。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种快速质粒DNA抽提纯化试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：重悬液、裂解液、中和液、清洗液、洗脱液；

所述重悬液的配方如下：葡萄糖100mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸10mM，乙二胺四乙酸10mM，核糖核酸酶5mg/ml；

所述裂解液的配方如下：氢氧化钾或氢氧化钠100mM-2M，十二烷基苯磺酸钠或十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠1g/100mL；

所述中和液的配方如下：盐酸胍1M-6M，醋酸钾或醋酸钠100mM-1M，醋酸调节pH至2-8。

优选地，所述清洗液的配方如下：三羟甲基氨基甲烷盐酸1-50mM，pH6.8，体积分数为乙醇70-85％。

优选地，所述洗脱液的配方如下：乙二胺四乙酸1-10mM，三羟甲基氨基甲烷盐酸8-12mM，pH8-9。

优选地，所述裂解液的配方优选为：十二烷基苯磺酸钠1g/100mL，氢氧化钠0.1M

优选地，所述中和液的配方优选为：盐酸胍5M，醋酸钠0.75M，醋酸调PH至5.0

上述快速质粒DNA抽提纯化试剂盒在质粒提取中的应用在本发明的保护范围之内。

进一步地，包括如下步骤：

(1)菌体重悬：取2mL过夜培养的细菌溶液，4000rpm离心2min，弃上清，在沉淀的菌体中加入250μL的所述的重悬液，充分震荡混匀；

(2)菌体裂解：将250μL所述的裂解液加到充分重悬的菌体中，轻柔混匀至菌液清亮；

(3)中和沉淀：将250μl所述的中和液加入步骤(2)裂解清亮的菌体中，上下翻倒离心小管5-10次，混合，4000rpm离心10min，弃除沉淀取上清液挂硅胶柱；