[发明专利]一种大黄鱼增殖放流的分子标志物及其筛选方法

权利要求书

1.一种分子标志物用于大黄鱼增殖放流的应用，其特征在于所述的分子标志物包括3,4-二羟基杏仁酸、对羟基苯基乙酰硫代氢氧酸酯、丙基戊二酸、皮质醇、麦角硫茵氨基酸、(R)-甲羟戊酸、循环去氧黄嘌呤氟他洛辛、甲羟戊酸、生物素、8-氨基-7-氧代壬酸酯、N-花生四烯多巴胺、肾上腺素、δ1-哌啶-2-羧酸酯、肌酸、卡利车霉素T0、L-2-氨基己二酸酯6-半醛、α-1，6半乳三糖、丁醛、脂酰AMP和乙酰假藤碱，其中显著上调的为3,4-二羟基杏仁酸、对羟基苯基乙酰硫代氢氧酸酯、丙基戊二酸、皮质醇、麦角硫茵氨基酸、(R)-甲羟戊酸、循环去氧黄嘌呤氟他洛辛、甲羟戊酸、生物素、8-氨基-7-氧代壬酸酯、N-花生四烯多巴胺、肾上腺素；显著下调的为δ1-哌啶-2-羧酸酯、肌酸、卡利车霉素T0、L-2-氨基己二酸酯6-半醛、α-1，6半乳三糖、丁醛、脂酰AMP、乙酰假藤碱。

2.一种大黄鱼增殖放流的分子标志物基于LC-MS/MS技术的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：取暂养不同时间的大黄鱼肌肉样本，采用LC-MS/MS定性及定量的确定大黄鱼肌肉组织的小分子代谢物，通过火山图和主成分分析确定大黄鱼鱼苗适应放流水域的时间，通过偏最小二乘判别分析和维恩图筛选出可以指示大黄鱼已经适应放流环境的分子标志物，具体步骤如下：

（1）从转移至暂养水域第一天开始，每隔4天采集6只大黄鱼鱼苗并提取肌肉组织样品，采用有机溶剂沉淀蛋白法对大黄鱼肌肉样本进行提取，提取液经过滤得待测液；

（2）大黄鱼样品的检测分析：将待测液进行液相色谱分离后，将色谱柱上洗脱下来的小分子，利用高分辨串联质谱分别进行正负离子模式采集，通过商业软件Progenesis QI实现峰提取，基于数据库KEGG进行代谢物鉴定；

（3）统计学分析：利用代谢组学R软件包metaX对质谱数据进行统计分析，通过火山图和主成分分析确定大黄鱼鱼苗适应放流水域的时间为16天，通过偏最小二乘判别分析和维恩图筛选出可以指示大黄鱼已经适应放流环境的分子标志物，其中显著上调的为3,4-二羟基杏仁酸(3,4-Dihydroxymandelic acid)、对羟基苯基乙酰硫代氢氧酸酯(p-Hydroxyphenylacetothiohydroximate)、丙基戊二酸(2-Propylglutaric acid)、皮质醇(Cortisol)、麦角硫茵氨基酸(Ergothioneine)、(R)-甲羟戊酸((R)-Mevalonate)、循环去氧黄嘌呤氟他洛辛(Cyclic dehypoxanthine futalosine)、甲羟戊酸(Mevalonic acid)、生物素(Biotin)、8-氨基-7-氧代壬酸酯(8-Amino-7-oxononanoate)、N-花生四烯多巴胺(N-Arachidonyldopamine)、肾上腺素(Adrenosterone)；显著下调的为δ1-哌啶-2-羧酸酯(Delta1-Piperideine-2-carboxylate)、肌酸(Creatine)、卡利车霉素T0(Calicheamicin T0)、L-2-氨基己二酸酯6-半醛(L-2-Aminoadipate 6-semialdehyde)、α-1，6半乳三糖(D-Gal alpha1-6D-Gal alpha 1-6D-Glucose)、丁醛(Butanal)、脂酰AMP(Lipoyl-AMP)、乙酰假藤碱(Acetyl pseudotropine)。

3.根据权利要求2所述的一种大黄鱼增殖放流的分子标志物基于LC-MS/MS技术的筛选方法，其特征在于步骤（2）中液相色谱分离条件为采用ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱进行色谱分离，色谱柱的柱温为50℃，流速为0.4 ml/min，其中A流动相为含有0.1%v/v甲酸的水溶液，B流动相为含0.1%v/v甲酸的甲醇溶液，对代谢物采用以下梯度进行洗脱：0-2 min，100%流动相A；2-11 min，0-100%流动相B；11-13 min，100%流动相B；13-15 min则为0-100%流动相A，每个样本的上样体积为5 µL。

4.根据权利要求2所述的一种大黄鱼增殖放流的分子标志物基于LC-MS/MS技术的筛选方法，其特征在于步骤（2）中高分辨串联质谱分别进行正负离子模式采集具体如下：正离子模式下，毛细管电压和锥孔电压分别为3.0 kV 和40.0 V；负离子模式下，毛细管电压及锥孔电压分别为2.0 kV和40.0 V，采用MSE模式进行centroid数据采集，一级扫描范围为50-1200 Da，扫描时间为0.2s，对所有母离子按照20到40 eV的能量进行碎裂，采集所有的碎片信息，扫描时间为0.2 s。