[发明专利]高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌及其在合成α-酮戊二酸中的应用

说明书

本发明公开了一种高效合成α‑酮戊二酸的基因工程菌及其在合成α‑酮戊二酸中的应用，通过大肠杆菌为宿主表达L‑氨基酸脱氨酶Pm1的Escherichia coli BL21(DE3)，所述L‑氨基酸脱氨酶Pm1通过质粒pET20b‑N2‑pm1‑Q100I在大肠杆菌BL21中表达；大肠杆菌宿主为表达L‑氨基酸脱氨酶Pm1的Escherichia coli BL21(DE3)，所述L‑氨基酸脱氨酶Pm1通过质粒pET20b‑N2‑pm1‑Q100I在大肠杆菌BL21中表达，提高了L‑氨基酸脱氨酶Pm1的酶活和表达量的方法，通过L‑氨基酸脱氨酶Pm1的基因序列的N端融合了N端编码序列，重组质粒构建获得的质粒pET20b‑N2‑pm1‑Q100I应用到合成α‑酮戊二酸中，合成效率高、难度小且污染低。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，还涉及该工程菌在合成α-酮戊二酸中的应用。

背景技术

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循环中重要的代谢中间产物，是连接细胞内碳-氮代谢的关键节点，被广泛应用于医药、食品和化学合成行业。然而，化学法合成α-酮戊二酸对环境的污染较大，而微生物直接发酵法中，产物的成分复杂且分离难度大。生物催化法合成α-酮戊二酸可以克服上述两种方法的缺点和不足，在工业应用中具有广阔前景。

L-氨基酸脱氨酶(EC 1.4.3.2)广泛存在于自然界各种生物中。不同来源的L-氨基酸脱氨酶具有高度保守性，其主要区别为每类L-氨基酸脱氨酶均对特定的一种或几种氨基酸或其氨基酸衍生物表现出较高的底物亲和性，而对其他氨基酸的亲和性较差。有研究表明，Proteus mirabilis来源的L-氨基酸脱氨酶Pm1，能催化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸。

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一种可用于高效表达含T7启动子的表达载体的菌株，其遗传背景清晰，分子操作工具成熟且多样，是一种被广泛用作表达重组蛋白的生产宿主。

半理性设计策略是酶工程改造的一种重要策略，分子对接是常用的半理性设计手段。分子对接是利用计算机模拟并分析分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法，可预测出蛋白待突变的位点，进而通过定点饱和突变筛选出酶活提高的突变体。

近年来，N端编码序列被证实对蛋白的表达有调控作用。因此，可以通过在基因N端添加对蛋白表达促进作用较强的编码序列，以筛选得到蛋白表达水平提高的菌株。

但如何利用大肠杆菌，通过全细胞催化法高效合成α-酮戊二酸，仍是本领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够大幅提高酶活和表达量，且α-酮戊二酸合成率高的高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：高效合成α-酮戊二酸的基因工程菌，大肠杆菌宿主为表达L-氨基酸脱氨酶Pm1的Escherichia coli BL21(DE3)，所述L-氨基酸脱氨酶Pm1通过质粒pET20b-N2-pm1-Q100I在大肠杆菌BL21中表达。

作为优选的技术方案，所述L-氨基酸脱氨酶Pm1的基因序列的N端融合了N端编码序列，且第100位的谷氨酰胺突变为异亮氨酸，形成所述质粒pET20b-N2-pm1-Q100I，所述质粒pET20b-N2-pm1-Q100I的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选的技术方案，所述质粒pET20b-N2-pm1-Q100I的构建方法，包括如下步骤：

(1)分子对接与饱和突变位点的选择

在SWISS MODEL数据库中搜索所述L-氨基酸脱氨酶Pm1的同源酶晶体模型，选择的所述同源酶晶体模型的同源性至少为90％；