[发明专利]一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法

说明书

一种分析人参‑桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，属于植物药对研究技术领域，本发明通过体外药效学结合网络药理学和分子对接技术研究人参、桑椹单味药及药对不同极性组分对小鼠睾丸间质细胞TM3增值率及睾酮分泌影响和药对不同极性组分对成骨细胞MC3T3‑E1增值率及碱性磷酸酶ALP活力的影响；通过中药成分数据库TCMSP、GeneCards、OMIM数据库分别收集人参、桑椹化学成分，成分及疾病相关靶点，两者取交集后，运用STRING数据库分析关键靶点间的蛋白相互作用，利用DAVID数据库进行生物功能和通路分析；相关结果采用Cytoscape 3.7.0进行构图和网络拓扑结构分析；并应用Autodock软件对潜在药效物质和关键靶点进行分子对接。

技术领域

本发明属于植物药对研究技术领域，特别是涉及到体外药效学结合网络药理学和分子对接技术研究及探索人参-桑椹药对骨质疏松症的机制。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨代谢紊乱、微结构损坏为主要特征, 并且由于骨量流失及强度降低,日后容易并发主要部位的脆性骨折。OP的发病率随着人口老龄化的加重而逐年上升。现在它已经成为世界上第七大最常见的疾病。研究显示,中药及其复方具有整体调节作用，激素水平得到调节，机体免疫力得到提高，促进骨密度增加，改善和修复受损的小梁骨微结构，治疗OP患者的疾病。它在预防和治疗OP方面具有较高的安全性和独特的优势，但其具体作用机制尚不清楚。随着网络药理学的发展和应用，从靶向生物信号网络的角度进行深入分析，对中医药防治OP的研究领域具有重要意义。《素问·痿论篇》曰:“肾主骨之骨髓”肾藏精,精生髓,髓居于骨腔中,以滋养骨骼,当肾精亏虚时,则骨枯髓减。因此，肾虚是骨质疏松症的主要病因，而肾精的升降决定了骨的强弱，因此补肾中药被广泛应用于骨质疏松症的防治。人参为五加科植物(Panax ginseng C.A.Mey)。2020版药典记载人参具有大补元气，强精补肾之功效。桑椹为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥果穗。2020版药典记载归心、肝、肾精。具有治疗肝肾阴虚，关节不利，滋阴补血之功效。中医认为，肾藏精，精生髓，髓养骨。从生理上讲，肾脏储蓄先天的精华，可以转化为骨髓。骨髓储存在骨头里，骨髓充实则骨骼生长强硬；病理上，肾精亏虚，骨髓不足，骨质流失，导致各种骨病。近年来，大量研究表明人参和桑椹都具有治疗骨质疏松的作用，但目前主要集中于单味药治疗骨质疏松的研究，二者联合用药后治疗骨质疏松的研究未见报道。

自2008年发出以来，网络药理学成为一门新兴学科，在调控水平上揭示了中药在人体调节网络中的作用。由于其整体，系统的研究方法以及药物与中药的多靶点，多病理特征共同作用的特点，已成为系统分析多靶点，多路径机制的有效工具。多项研究利用网络药理学探索中药作用机制已经取得成功。因此，现有技术中亟需一种采用细胞实验并结合网络药理学方法，探究人参、桑椹单味药及药对配伍的不同极性组分治疗骨质疏松作用的效果及其分子机制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，通过体外药效学结合网络药理学以及分子对接技术，验证人参-桑椹对骨质疏松症作用机制，将体外药效学试验结果与网络药理学获得的关键靶点及通路相对应，确定具体潜在药效物质及其分子机制，为其后续开发应用提供参考。

一种分析人参-桑椹抗骨质疏松作用机制的方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、取人参单味药、桑椹单味药以及人参-桑椹联合药，分别加10倍量水以及8倍量乙醇，浸泡0.5h，提取2次，每次提取1h及2h，合并2次滤液，得到人参水提液GW、桑椹水提液MW、人参醇提液GC、桑椹醇提液MC、人参和桑椹水提物配伍GMW、人参和桑椹醇提物配伍GMC，减压浓缩制成干膏，置4℃冰箱保存待用；

步骤二、取骨细胞MC3T3-E1和睾丸间质细胞TM3，在37℃恒温条件下，5％CO2 培养箱中培养含10％胎牛血清和MEM培养基的细胞，细胞贴壁后取出培养基，用 PBS洗涤三次至无漂浮细胞；再次加入培养基继续培养；当细胞被80％～90％覆盖时，用0.25％胰蛋白酶传代，每2～3天传代一次；取对数生长期细胞待用；