[发明专利]检测胰岛素与白蛋白结合活性的方法

说明书

本发明提出了一种细胞裂解液。该细胞裂解液包括：0.4％～5％Triton X‑100，100～200mM NaCl和25～75mM HEPES。该细胞裂解液利用Triton X‑100这种温和型的非离子表面活性剂作为裂解液的主要成分，可以破坏细胞膜，但对细胞核膜的作用较弱，既能达到细胞裂解的作用，又不会使基因组等复合物释放出来，避免透明胶状物的产生，从根源上解决液体粘稠及实验数据误差大的问题。该细胞裂解液特别适用于细胞蛋白磷酸化检测中对细胞样品的裂解处理。

技术领域

本发明涉及生物医药检测领域，具体地，本发明涉及细胞裂解液、试剂盒、检测细胞蛋白磷酸化活性的方法以及检测胰岛素与白蛋白结合活性的方法。

背景技术

脂肪酸修饰的胰岛素与白蛋白的可逆性结合和解离，缓慢释放出胰岛素，延缓胰岛素对胰岛素受体的磷酸化作用。胰岛素的脂肪链与白蛋白可逆性结合，延长作用时间，是胰岛素延迟作用机制之一。因此，通过检测胰岛素受体的磷酸化活性，可用来评估脂肪酸修饰胰岛素与白蛋白的结合活性。

发明内容

本申请是发明人基于对下列问题的发现和认识所作出的：

现有检测细胞蛋白磷酸化的试剂盒中的裂解液作用剧烈，裂解细胞的过程中释放出细胞中的基因组等复合物，使裂解产物中出现了团状透明胶状物，且现有试剂盒中的裂解液的对细胞的裂解效果易受反应温度、转速、裂解液体积等因素的影响，该裂解液的裂解作用呈现一定的不稳定性。此外，裂解后粘稠液体非常不便于转移，且易于被转移至反应体系，从而造成待测刺激化合物，如胰岛素，复孔间的CV值偏大、反应曲线的拟合度差。

针对现有检测细胞蛋白磷酸化的试剂盒中裂解液裂解效果不稳定，本发明提出一种新的细胞裂解液配方。利用Triton X-100这种温和型的非离子表面活性剂作为裂解液的主要成分，再结合试剂盒的裂解抑制剂，替代试剂盒中的强裂解液，可以破坏细胞膜，但对细胞核膜的作用较弱，既能达到细胞裂解的作用，又不会使基因组等复合物释放出来，避免透明胶状物的产生，从根源上解决液体粘稠及实验数据误差大的问题，本方案易于操作，稳定性及重复性好。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种细胞裂解液。根据本发明的实施例，所述细胞裂解液包括：0.4％～5％Triton X-100，100～200mM NaCl和25～75mM HEPES。根据本发明实施例的细胞裂解液利用Triton X-100这种温和型的非离子表面活性剂作为裂解液的主要成分，可以破坏细胞膜，但对细胞核膜的作用较弱，既能达到细胞裂解的作用，又不会使基因组等复合物释放出来，避免透明胶状物的产生，从根源上解决液体粘稠及实验数据误差大的问题。根据本发明实施例的细胞裂解液特别适用于细胞蛋白磷酸化检测中对细胞样品的裂解处理。

根据本发明的实施例，上述细胞裂解液还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述细胞裂解液包括：0.5％～5％Triton X-100，150mMNaCl和50mM HEPES，优选地，0.5％～2％Triton X-100。进而细胞可完全裂解，且裂解后的液体没有粘稠现象出现。

根据本发明的实施例，进一步包括酶抑制剂，所述酶抑制剂包含但不限于蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或其混合物，可以有效抑制细胞裂解后各种蛋白酶的活性，防止蛋白质水解，也能更好的保护磷酸化的蛋白，保持其完整性和天然活性。其中蛋白酶抑制剂通常包括丝氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶的抑制剂，磷酸酶抑制剂通常包括酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸、酸性和碱性磷酸酶的抑制剂。