[发明专利]检测胰岛素与白蛋白结合活性的方法

权利要求书

1.一种细胞裂解液，其特征在于，包括：0.4％～5％Triton X-100，100～200mM NaCl和25～75mM HEPES。

2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，包括：0.5％～5％Triton X-100，150mM NaCl和50mM HEPES，优选地，0.5％～2％Triton X-100。

3.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，进一步包括酶抑制剂，所述酶抑制剂包括蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或其混合物；

任选地，所述蛋白酶抑制剂包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂以及金属蛋白酶的抑制剂的至少之一；

任选地，所述磷酸酶抑制剂包括酪氨酸磷酸酶抑制剂、丝氨酸或苏氨酸磷酸酶抑制剂、酸性磷酸酶抑制剂和碱性磷酸酶的抑制剂的至少之一；

任选地，所述酶抑制剂包括选自钒酸盐或过氧钒、抑肽素、亮肽素、PMSF或AEBSF、Blocking reagent、Halt^TMProtease and Phosphatase Inhibitor Cocktail的至少之一。

4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3中任一项所述的细胞裂解液。

5.权利要求1～3中任一项所述的细胞裂解液在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测蛋白磷酸化活性。

6.一种检测细胞蛋白磷酸化活性的方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1～3中任一项所述的细胞裂解液对待测细胞进行裂解；

将裂解上清液进行酶标检测，以便获得荧光值；

基于荧光值-蛋白磷酸化活性对应曲线，获得所述蛋白磷酸化活性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解是在温度为20-30℃、转速为250rpm-400rpm的条件下进行30-90min。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测细胞和所述细胞裂解液的个数体积比为(1～3*10⁴)个：(50～100)μL，优选，2*10⁴：(50～100)μL。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶标检测以337nm为激发波长，检测665nm、620nm的荧光值。

10.一种检测胰岛素与白蛋白结合活性的方法，所述胰岛素具有脂肪酸修饰，其特征在于，包括：

利用待测胰岛素与白蛋白的混合溶液对细胞进行刺激；

利用权利要求6～9所述的方法对刺激后的细胞进行处理，以便获得所述细胞的胰岛素受体磷酸化活性；

基于所述胰岛素受体磷酸化活性，确定所述胰岛素与白蛋白结合活性；

任选地，所述刺激是在37℃、5％CO₂的条件下进行5min；

任选地，所述细胞预先进行无血清培养基饥饿处理；

任选地，所述细胞在所述培养板中的密度为3～9*10⁴个/cm²，优选，6～7*10⁴个/cm²。