[发明专利]用于检测糖类抗原的基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针、制备方法

说明书

本发明属于生物医学及抗原检测技术领域，具体涉及一种检测糖类抗原的基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针、制备方法。本发明包括步骤：a、志贺毒素B亚基重组蛋白的原核表达和纯化；b、含有生物素基团短肽的制备；c、上述重组蛋白与生物素化短肽的体外酶法融合修饰；d、生物素化志贺毒素B亚基重组蛋白与链酶亲和素标记量子点的偶联探针制备。本发明所述的探针，结合流式细胞术能够有效检测多种肿瘤细胞表面糖类抗原尤其如Gb3、Gb4的表达，可以应用于以Gb3、Gb4等糖类抗原为肿瘤标志物的检测和诊断。所述糖类抗原检测方法，制备成本低、检测专一性强、灵敏度高。

技术领域

本发明属于生物医学/抗原检测技术领域，具体涉及一种用于检测糖类抗原的基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针、制备方法。

背景技术

糖类抗原是一种肿瘤标志物。糖基化水平和结构的改变是肿瘤细胞的普遍特征，因此某些糖类抗原可以作为标志物用于肿瘤的检测诊断和治疗。糖类抗原不是某种特定种类肿瘤所特有的，不同的糖类抗原在不同的恶性肿瘤中存在特异性，而作为联合标志物应用还可以进一步提高恶性肿瘤诊断的准确率。常见的肿瘤相关糖抗原包括，Gb3、Gb4、Globo-H、GM2、GD2、GD3、Fuc-GM1、LeY、SSEA、forssman等。

鞘糖脂Gb₃是一种中性的糖类抗原，其结构为Gal1-4Gal1-4Glc-Cer。鞘糖脂Gb₃广泛存在于哺乳动物细胞膜表面，在细胞的生长、分化、信号传导等方面起到非常重要的作用。鞘糖脂Gb₃的非正常表达会引起机体一系列的病变反应。目前的研究结果表明：鞘糖脂Gb₃的过量表达与结肠癌的转移有关，目前发现几乎所有癌细胞转移都伴随着细胞表面糖基化的改变。

现行对Gb₃的检测主要是使用商业化抗Gb₃抗体进行蛋白质印迹实验。由于实验周期长、商业化抗体昂贵等原因限制了其应用。

志贺毒素是志贺氏菌和某些大肠杆菌产生的毒力蛋白因子，可以特异性的结合人体宿主细胞表明的Gb₃糖类抗原。志贺毒素是由A亚基蛋白质和B亚基蛋白组成的复合物，A亚基蛋白具有毒力活性，B亚基具有Gb₃糖抗原结合活性。志贺毒素包括志贺毒素1和志贺毒素2两种类别。志贺毒素B亚基蛋白包括志贺毒素1B亚基和志贺毒素2B亚基。

志贺毒素B亚基的功能是特异性结合Gb₃糖类抗原。志贺毒素B亚基单独存在时不具有志贺毒素的毒性活力，但保持了志贺毒素对Gb₃糖类抗原的结合特性，因此可以以重组的志贺毒素B亚基蛋白作为Gb₃识别单位开发肿瘤细胞Gb₃糖类抗原的检测探针。

但是，目前尚无有效的利用志贺毒素B亚基制备Gb₃的检测探针的相关报道。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于检测糖类抗原的基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针、制备方法，

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明是一种检测糖类抗原的基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针，首先外源表达志贺毒素B亚基重组蛋白，然后将志贺毒素B亚基重组蛋白与生物素化短肽进行体外酶法融合修饰，得到生物素化志贺毒素B亚基重组蛋白，最后将生物素化志贺毒素B亚基重组蛋白与链霉亲和素标记量子点偶联形成探针。

所述的外源表达，包括在原核大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中。

本发明的一个目的在于，提供一种用于检测糖类抗原的基于志贺毒素B亚基重组蛋白的探针，该探针由以下两个部分偶联形成：

a、生物素化志贺毒素B亚基重组蛋白，

b、链霉亲和素标记量子点；