[发明专利]一株高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一株高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌突变菌株及其应用。所述枯草芽孢杆菌突变菌株是通过紫外诱变方法筛选获得的，阿洛酮糖差向异构酶产量得到显著提高，保藏编号为CGMCC No.19500。所述菌株可广泛应用于阿洛酮糖差向异构酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖C-3位上的差向异构体属于稀少糖的一种，是一种新型的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖的CAS号为551-68-8。美国食品药品监督管理局（U.S. Food andDrug Administration，FDA）于2014年正式批准D-阿洛酮糖为一般公认安全（GenerallyRecognized as Safe，GRAS），允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。

D-阿洛酮糖可以通过化学合成和生物合成两种途径获得。但化学合成存在着很多弊端，例如复杂的纯化步骤，化学废料和无价值副产物的生成。稀少糖D-阿洛酮糖在自然界中存在的含量极少，而在化学法合成的过程中存在诸多问题，因此具有高度的专一性（反应专一性和底物专一性）的生物催化法合成D-阿洛酮糖引起了广泛的关注。根据Izumoring稀有糖转化策略，酮糖3-差向异构酶在D-阿洛酮糖生物转化中起着不可替代的作用——催化D-果糖和D-阿洛酮糖在C-3位置发生可逆的差向异构化反应。目前，对于酮糖3-差向异构酶的研究已经较为广泛，包括微生物筛选鉴定、酶的分离纯化、异源重组表达、酶固定化、食品级表达、分子改造和晶体结构解析。

截至目前为止，已有文献报道确认的酮糖3-差向异构酶仅有11种。根据最适底物的不同，这11种酮糖3-差向异构酶可以分为D-塔格糖3-差向异构酶（D-tagatose3-epimerase，DTEase），D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase，DPEase）和L-核酮糖3-差向异构酶（L-Ribulose 3-epimerase，LREase）。2006年，韩国Deok-Kun Oh教授团队从微生物Agrobacterium tumefaciens ATCC33970中发现的酮糖3-差向异构酶，可以有效地催化D-果糖和D-阿洛酮糖的相互转化，因最适底物为D-阿洛酮糖，命名为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（以下简称为阿洛酮糖差向异构酶）。2009年张文立等年发现了最适底物为D-果糖的D-塔格糖3-差向异构酶，微生物来源为Rhodobacter sphaeroides SK011；此后，又陆续报道了其他6种D-阿洛酮糖3-差向异构酶，最适底物均为D-阿洛酮糖，微生物来源分别为：Clostridium cellulolyticum H10、Clostridium scindens ATCC 35704、Clostridiumbolteae ATCC BAA-613、Clostridium sp. BNL1100、Desmospora sp. 8437、Treponemaprimitia ZAS-1。2012年，孙媛霞教授团队报道了来源于Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，最适底物为D-阿洛酮糖。

目前，不同微生物来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶已在大肠杆菌中表达。大肠杆菌本身不属于GRAS菌株，不能用于食品工业。所以选择食品级安全的菌株来表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有重要意义，也是本领域的研究重点。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（以下简称为阿洛酮糖差向异构酶）的枯草芽孢杆菌菌株，并提供了其在该酶生产中的应用。申请人首先构建得到重组表达来源于解纤维梭菌（ Clostridium cellulolyticum）的阿洛酮糖差向异构酶的枯草芽孢杆菌菌株，然后进一步对其进行紫外诱变，筛选获得阿洛酮糖差向异构酶产量显著提高的突变菌株，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。