[发明专利]一种细胞固定剂、细胞固定方法和应用

说明书

本申请涉及细胞生物学领域，具体公开了一种细胞固定剂、细胞固定方法和应用。本申请的细胞固定剂有效成分特异性针对蛋白上的特定有机基团通过形成共价键进行交联，其具有化学活性的两端中间含有一个间隔臂，间隔臂的长度不小于0.5纳米，间隔臂可被选择性的切断，本申请的细胞固定剂可用于固定细胞，其具有兼顾保护蛋白抗原且稳定细胞内核酸优点。本申请的细胞固定方法包括（1）将所述细胞固定剂采用PBS缓冲液稀释；（2）将细胞样本加入稀释后的细胞固定剂中孵育。本申请的细胞固定剂应用于免疫荧光技术中。

技术领域

本申请涉及细胞生物学领域，更具体地说，它涉及一种细胞固定剂、细胞固定方法和应用。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，测序成本大大降低，这促使了各种组学技术的发展以及在生物学和医学研究中的广泛应用。近年来，单细胞测序成为了生物医学研究中的一个新热点。传统的基因测序以大量细胞为研究对象，揭示了细胞中普遍性的基因表达调控或疾病机制，但忽视了单细胞间的异质性。单细胞测序技术的开发与发展能够帮助研究人员分析细胞群体的异质性，揭示各细胞间在基因表达与基因变异等方面的不同。

具体来说，单细胞测序是指在单个细胞水平上对细胞的基因组或转录组进行测序，可分为单细胞基因组测序(single cell genome sequencing)与单细胞转录组测序(single-cell transcriptome sequencing)两大类。因此单细胞测序技术能够揭示少量细胞所具有的独特表型。单细胞基因组测序技术可以在单细胞尺度上鉴定肿瘤细胞基因突变或拷贝数变异的异质性。比如，在试管婴儿胚胎移植前，可应用单细胞基因组测序技术可以进行基因遗传疾病的筛查，筛选不携带致病基因突变或拷贝数变异的胚胎进行移植，从而避免出生缺陷。单细胞转录组测序技术则可以从单细胞水平检测基因表达，从而避免大量细胞转录组测序时基因表达被平均化，有利于揭示细胞内基因表达调控特征，发现新的细胞类型。

单细胞测序除了针对一群细胞检测其异质性外，还经常需要对特定的细胞群体进行检测，而特定的细胞群体往往可以通过蛋白标志物的单克隆抗体来标记。即先通过针对蛋白标志物的免疫染色找到目标细胞，然后对目标细胞进行进一步的核酸检测。

同时，在医学研究中，也有同时检测细胞抗原表达与对核酸测序的需求。由于细胞样本保存和运输的需要，以及细胞内蛋白的检测需要，先对细胞进行固定以保持蛋白抗原结构的完整与稳定，因此就需要发展一种细胞固定方法能够同时兼容细胞内蛋白检测与单细胞测序(包括DNA测序与RNA测序)。这种固定方法除了能够保持蛋白抗原的结构和构象，还能够有效保护核酸的完整性，并与目前的单细胞测序方法能够兼容。

目前常用的细胞固定剂有醛类试剂、醇类试剂等有机溶剂。醛类试剂通过形成化学交联键固定细胞，即交联细胞内可溶性蛋白、细胞骨架以及核酸，其中可形成交联的蛋白质末端基团包括氨基，巯基、胍基、羟基和芳香环等。

例如，现有中国专利申请号为2018115877086的专利文件公开了《一种固定细胞的方法及细胞固定试剂》，其采用乙二醛固定液替代多聚甲醛，对人体健康危害较小。

又如中国专利申请号为2019108971410的专利文件公开了《一种细胞固定的方法》，采用0.5-5体积％的甲醛溶液，优选1-2体积％的甲醛溶液还更优选1.33体积％的甲醛溶液固定细胞的步骤，无需特殊的仪器来处理细胞，并且成本低廉，操作简便。

虽然醛类固定剂固定细胞引入的亚甲基桥可很好的维持细胞形态，免疫荧光染色效果较好，但由于其可使蛋白与核酸形成交联结构，因此可能会改变蛋白抗原的结构，导致假阴性的结果，同时固定剂会损伤核酸，不利于单细胞测序。

醇类固定剂可引起细胞脱水，从而凝固细胞内可溶性蛋白。这一方法固定细胞会影响细胞形态和免疫染色的效果，在免疫荧光染色中使用较少。