[发明专利]同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及其元件结构

说明书

本发明公开了同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及元件结构，所述方法包括：(1)以靶区段300‑400bp DNA序列为基础，其中插入或缺失多个DNA片断形成MsDFID序列，同时作为向导RNA和供体模板，也被称为MsDFID向导和供体RNA；(2)在所述MsDFID供体模板3’端连接成簇且规律间隔短重复DNA回文结构，即PCRISR，或Cas9向导RNA骨架，或大肠杆菌CRISPR‑Cas3回文重复序列。后面这三种序列均作为向导RNA骨架；(3)用上述融合序列构建供体载体，转化大肠杆菌，MsDFID供体模板内供体位点所含DNA片断插入或缺失被替换到靶区段对应位点。本发明成功实现以序列替换为唯一效果的基因编辑，解决当前基因编辑系统面临的几个主要问题：对PAM序列依赖、较高脱靶风险和难以实现精准序列替换。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种全新的不依赖PAM、同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法。

背景技术

基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。这种靶向突变就是基因编辑。

目前，在基因编辑领域，一种非常惯用且有效的编辑技术就是CRISPR-Cas9技术。CRISPR是细菌遗传密码及其免疫系统的一个定义性特征，是细菌用来保护自己免受病毒攻击的防御系统。它也存在于古生物界(单细胞微生物)中的生物体中。CRISPR是一系列重复的DNA序列，并且这些DNA之间存在“spacers”。细菌利用这些基因序列来“记住”攻击它们的每种病毒。细菌会将病毒的DNA整合到自己的细菌基因组中。这种病毒DNA最终成为CRISPR序列中的“spacers”。这种防御系统可以在同种病毒再次发起攻击时给予细菌保护或免疫力。

虽然，CRISPR-Cas9技术存在着广泛的应用，但是综合目前的基因编辑研究报道，总的来看，仍面临几个重要问题。一是对PAM序列的依赖；二是较高的脱靶风险；三是很少有通过同源重组实现精准序列替换的基因编辑技术工具，不依赖PAM，且没有脱靶风险或脱靶风险很低。

发明内容

针对CRISPR-Cas9技术所存在的上述问题，本申请的发明人希望提供一种基因编辑技术，其能够在目标位点实现对特定片段的精准替换。

具体而言，本申请的发明人在进行基因编辑研究过程中注意到，水稻等自然界植物和微生物中存在着大量的、具有一种特殊规律的片段，这里发明人将其命名为PCRISR结构序列，该结构具有一共性，即均包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，短重复序列之间包含20bp左右的间隔序列，整个结构对称折叠呈“发卡”状(参见图1)。

本申请的发明人在进一步研究中注意到，该特殊结构与特定的供体模板融合重组后，转入到大肠杆菌，能够实现一种唯一效果：序列替换。由于CRISPR-Cas9技术在基因编辑时是以基因功能敲除(knock out)的方式进行，所以其可能带来的效果存在多样性和不确定性，而采用本发明的方法，可以实现编辑的确定性效果，这是具有巨大研究价值和商业价值的。

本发明方案如下：

一种同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

(1)以靶区段的DNA序列为基础，通过在对应于靶区段的同源臂之间插入或缺失多个DNA片断来形成MsDFID供体模板，这些DNA片断插入或缺失位点则形成供体位点(donorsite)；