[发明专利]同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法及其元件结构

权利要求书

1.一种同源重组机制介导的精准序列替换基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：

（1）以靶区段的DNA序列为基础，通过在对应于靶区段的同源臂之间插入或缺失多个DNA片断来形成MsDFID供体模板，这些DNA片断插入或缺失位点则形成供体位点，这些供体位点将会被替换到对应的靶区段位点；（2）在所述MsDFID供体模板3’端连接PCRISR，或Cas9gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列，所述PCRISR结构包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且对称折叠呈“发卡”状，所述PCRISR作为“向导RNA骨架”，所述PCRISR结构的序列如序列表SEQ ID No. 13所示；

（3）将MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3gRNA scaffold序列的融合序列，即“单一向导和供体RNA”序列连接到表达载体，作为供体载体；（4）利用含有MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNA scaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列的融合序列的供体载体转化大肠杆菌；

（5）供体载体转化后，MsDFID供体模板中供体位点，包括DNA插入或缺失序列，将会替换到对应的靶区段位点，发生精准的DNA序列替换。

2.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述MsDFID供体模板中包含5-6个通过插入或缺失形成的供体位点，最长DNA插入片断为65 bp，最长DNA缺失片断为35 bp。

3.根据权利要求1所述的基因编辑方法，其特征在于，所述MsDFID供体模板序列如序列表SEQ ID No. 1-12之一所示。

4.一种用于同源重组机制介导的精准序列替换的DNA融合序列，即“单一向导和供体RNA”序列，其特征在于，所述DNA序列包括MsDFID供体模板和PCRISR，或Cas9 gRNAscaffold，或大肠杆菌CRISPR-Cas3 gRNA scaffold序列的融合序列，其中，所述MsDFID供体模板以靶区段的基因序列为基础，通过在其中插入或缺失若干供体位点来形成，所述PCRISR结构包含若干重复的“tcacaaaactaca”以及其反向互补序列，并且对称折叠呈“发卡”状，所述PCRISR结构连接在所述MsDFID供体模板3’端，所述PCRISR结构的序列如序列表SEQ ID No. 13所示。