[发明专利]一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法

说明书

本发明公开了一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法，采用离体的溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者癌旁组织，进行转录组测序分析，筛选那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的基因。再次采用溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者癌旁组织，运用实时荧光定量RT‑PCR进行验证；运用免疫印迹方法验证转录组测序所筛选基因编码的蛋白表达水平，最终筛选出表达一致的基因。最后进行临床验证，筛选出溃疡性结肠炎活动度的指标。本发明克服了传统方法通过查找文献、筛选基因，再逐步验证的缺点，本方法亦适用于克罗恩病、嗜酸粒细胞胃肠炎等疾病活动度指标的筛选，以及结肠部位息肉、肿瘤等疾病分期指标的筛选。

技术领域

本发明涉及结肠组织的转录组测序领域，具体涉及一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法。

背景技术

溃疡性结肠炎是一种病因不明的大肠黏膜慢性炎症和溃疡性病变，好发于20～40岁的青年，临床表现为慢性腹泻伴粘液脓血便，严重影响患者的生活质量和劳动能力。重症溃疡性结肠炎患者可并发中毒性巨结肠、肠穿孔及肠大出血，危及患者的生命。在我国溃疡性结肠炎的发病率有逐年增高的趋势，其发病机制尚未完全阐明，目前认为可能是环境、遗传及免疫等因素共同作用所致。结肠上皮细胞屏障功能损伤可能是溃疡性结肠炎发生发展的重要环节，它使肠黏膜通透性增加，细菌、毒素以及大分子物质容易穿过黏膜进入黏膜下层，导致局部免疫紊乱，加重其病理损伤。造成肠黏膜屏障功能损伤的因素有很多，包括炎症因子、整合素家族、钙通道调控蛋白、肠道细菌，以及丁酸盐、锌等。这些因素与溃疡性结肠炎疾病活动度是否有关联，能否作为临床评价疾病活动度的指标，抑或作为临床鉴别诊断的依据，缺乏进一步的证据。

转录组测序差异分析及功能富集分析，可以全面、系统的分析疾病进展过程中的差异表达基因，及其与相关信号通路的关系。通过对病理标本和正常对照的转录组测序差异分析及功能富集分析，并进行数据库的比对，可能发现一些文献没有报道、但与疾病密切相关的差异表达基因及其信号转导通路，对临床疾病发病机制的探讨、疾病严重程度的评估有重要的临床意义。

发明内容

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：

本发明的目的在于提供一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法，该方法实验过程简单，实验结果准确有效。

实现上述发明目的的技术方案是：

一种筛选溃疡性结肠炎疾病活动度指标的方法，具体步骤如下：

1)收取离体的溃疡性结肠炎患者结肠活检标本，以及结肠癌手术患者癌旁组织，放入RNA样本保存液中浸透5分钟，然后放入液氮中保存；

2)采用离体的溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者切除的癌旁组织，每组6例，提取组织mRNA进行反转录，进行转录组测序分析。分别根据FC值升位和降位排序，各筛选出各组的前20位基因；再进一步筛选出那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的新发基因；

3)采用离体的溃疡性结肠炎结肠活检样本和结肠癌手术患者切除的癌旁组织，每组各20例，提取结肠组织mRNA进行反转录，运用实时荧光定量RT-PCR验证转录组测序所筛选基因的转录差异；提取结肠组织蛋白，运用免疫印迹方法验证转录组测序所筛选基因编码的蛋白表达水平，最终筛选出表达一致的基因；

4)将筛选出表达一致的基因，进行临床验证。收取离体的溃疡性结肠炎患者结肠活检标本50例，免疫印迹方法检测上述基因所编码的蛋白水平，并与患者的疾病活动度进行相关分析，最终筛选出溃疡性结肠炎活动度的指标。

进一步地，步骤二筛选出的那些没有被国内外文献报道与溃疡性结肠炎相关的基因：ASS1、CAPRIN1。

本发明提供了使用上述方法筛选出的溃疡性结肠炎活动度的指标，精氨基琥珀酸合酶1(Argininosuccinate Synthase 1，ASS1)。

本发明的有益效果：