[发明专利]柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用，属于植物分子生物学领域。本申请筛选了13个内参基因的基因序列，通过5种算法(delta‑CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder)评估候选基因的稳定性，获得了柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因：novel16、cln‑miR6725、novel1、U6、novel6和pab‑miR159a，并相应的设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，提高检测结果的可信度。

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

柳杉(Cryptomeria fortunei Hooibrenk ex Otto et Dietr)，又名长叶孔雀松。乔木，其天然分布极其狭窄，主要分布在我国及日本等地。柳杉树形优美，材质优良，适应性强，生长快而持久，具有耐寒冷、干旱和瘠薄，抗风抗雪压能力等特性。在茶树不同组织中已有miRNA内参的研究(CN 105132417B)，但仅使用了geNorm和BestKeeper软件进行了内参选择。研究表明不同植物、品种、组织、处理下没有“完美”的内参基因，因此在定量实验前应该进行内参的筛选。现在关于柳杉不同组织的miRNA基因的研究还未曾有过报道。探究柳杉不同组织的基因表达差异的研究过程中，需要稳定可靠的内参基因作为参照来进行实时荧光定量PCR检测和验证基因的表达水平，因此筛选柳杉不同组织的稳定表达的内参基因对其实时荧光定量PCR检测结果的准确性起着关键作用。

发明内容

鉴于现有技术存在的问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因；本发明所要解决的第二技术问题在于提供柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因的专有引物；本发明所要解决的第三技术问题在于提供上述内参基因和/或内参基因的专有引物在柳杉不同组织的miRNA荧光定量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因，内参基因为novel16、cln-miR6725、novel1、U6、novel6和pab-miR159a基因，其中，novel16基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；cln-miR6725基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；novel1基因的核酸序列如SEQ IDNO.3所示；novel6基因的核酸序列如SEQ ID NO.4所示；pab-miR159a基因的核酸序列如SEQID NO.5所示。

检测所述的柳杉不同组织的miRNA荧光定量内参基因的专有引物，

novel16基因的引物序列如下：

novel16正向引物：5’-GCGTTTTTCCAATACCTCCTATACC-3’；

novel16反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；

cln-miR6725基因的引物序列如下：

cln-miR6725正向引物：5’-TGGCATCTGTCGAGGTCATCTA-3’；

cln-miR6725反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；

novel1基因的引物序列如下：

novel1正向引物：5’-CTTTCCGGATCCTCCCATGC-3’；

novel1反向引物：由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供；

U6基因的引物序列如下：

U6正向引物：5’-ACAGAGAAGATTAGCATGGCC-3’；