[发明专利]一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物、扩增反应液、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-1和B3-1、两条内引物FIP-1和BIP-1，以及两条环引物LB-1和LF-1；所述的引物序列如下：

外引物F3-1的序列为：TGGCGTTCCTTGTACAGC；

外引物B3-1的序列为：GCCATTATGGTGACTGTCCG；

内引物FIP-1的序列为：

CTCAAGGCAACGGCTCAGATCACTCCAGTCGATTGTTGGGAC；

内引物BIP-1的序列为：

GTGATCGGCATCATAGGCTGCATTCTATCCGGCTTGAAGGGT；

环引物LB-1的序列为：TCAGCAATGACATGCCCCA；

环引物LF-1的序列为：TCAATCCAACACGTTCCAGT。

2.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-2和B3-2、两条内引物FIP-2和BIP-2；所述的引物序列如下：

外引物F3-2的序列为：AATGACATGCCCCACACC；

外引物B3-2的序列为：TCGAAAGTCCACGCAGATG；

内引物FIP-2的序列为：

TCGGCCTACCGCTGCGAATAACTTGAAGCTTGCGGACAGT；

内引物BIP-2的序列为：

ACAGCATGCAGCTTGGTCGTGCAAAAGGGGGGCTGAAG。

3.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3-3和B3-3、两条内引物FIP-3和BIP-3，以及两条环引物LB-3和LF-3；所述的引物序列如下：

外引物F3-3的序列为：TTGTACAGCCTCCAGTCGA；

外引物B3-3的序列为：CATTATGGTGACTGTCCGCA；

内引物FIP-3的序列为：

GGCCTTCATTGCCAGCAATCTCTGTTGGGACACTGGAACGT；

内引物BIP-3的序列为：

AGTGATCGGCATCATAGGCTGCTCTATCCGGCTTGAAGGGT；

环引物LB-3的序列为：ATCAGCAATGACATGCCCCA；

环引物LF-3的序列为：CTCAGATCAAGGTCAATCCAAC。

4.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的扩增反应液，其特征在于，所述反应液包括权利要求1-3中任意一项所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的引物。

5.如权利要求4所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的扩增反应液，其特征在于，所述扩增反应液还包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP、MgCl₂、Betaine、Tris-HCl、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Triton X-100、Bst DNA聚合酶。

6.一种用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有洗涤液的离心管、含有裂解液的离心管、含有阴性对照溶液的离心管、含有阳性对照溶液的离心管以及8联排检测管，所述检测管设有测样孔，每一个所述测样孔内设置扩增反应液、核酸染料和稳定液，所述阴性对照溶液为0.9％的生理盐水，所述阳性对照溶液中含有羊布鲁氏菌基因非传染DNA片段，所述扩增反应液为权利要求4-5任意一项所述的扩增反应液。

7.如权利要求6所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为0.9％的生理盐水。

8.如权利要求6所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸染料为SYBR Green。

9.如权利要求6所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述裂解液为TRIZOL。

10.一种应用权利要求6-9中任意一项所述的用于羊布鲁氏菌LAMP检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、样本处理：取一定量的组织样本，将洗涤液加入组织样本中，充分混匀，室温静置充分液化，再对液化后的组织样本进行离心，收集沉淀；

S2、核酸提取：用裂解液重悬步骤S1中收集的沉淀，混匀，100℃温浴裂解5min～15min后，立即置于冰上，然后离心，保留上清液，上清液即为包含模板DNA的样本溶液；

S3、加样反应：取若干检测管分别标记阴性对照管、阳性对照管以及若干样本测样管，依次将阴性对照溶液、阳性对照溶液以及步骤S2中的样本溶液分别加入阴性对照管、阳性对照管和样本测样管中，并使各所述检测管中的溶液充分混合均匀，离心使液体集中到各所述检测管的底部，再将检测管置于60℃～65℃条件下保温30min～60min，最后使所述检测管中的扩增反应液、核酸染料充分混匀并离心，使充分反应的溶液聚集于所述检测管的底部；

S4、结果判读。