[发明专利]小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养方法

说明书

本发明涉及小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法。本发明对贴壁用细胞外基质进行了筛选，获得适合小鼠耳蜗螺旋器贴壁的基质。采用鼠尾胶和多聚鸟氨酸作为基质包被，获得了更好的贴壁效果，可使得小鼠耳蜗螺旋器细胞存活至8天。并且，在贴壁培养的过程中，使用添加凝血酶敏感蛋白‑1（TSP‑1）的无血清培养基作为补料，可获得更佳的细胞贴壁培养效果，包含小鼠耳蜗螺旋器的基底膜在贴壁培养的第8天内外毛细胞仍然保持良好的形态，且培养至10天细胞仍然存活。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养方法。

背景技术

听觉异常是人类发生率最高的残疾之一，大多数听力丧失的病例都存在基因缺陷。有数十个基因位点分别和显性与隐性耳聋有关，这些耳聋基因许多表达于耳蜗毛细胞和支持细胞，所以毛细胞所导致的听力丧失是耳聋的主要原因。螺旋器，又称柯蒂氏器、柯替氏器(organ of Corti)。螺旋器内含有特殊的感觉上皮细胞，即毛细胞，可以将通过外耳和中耳传入内耳基底膜的声能转化为神经冲动传入大脑。耳蜗螺旋器是一个高度组织化的镶嵌体结构，由于内耳很小，而且组织细胞有限，非常难以分离和纯化，这严重妨碍和限制了对听觉、耳蜗的分子细胞生物学和遗传学的研究。因此，对于包含毛细胞的螺旋器的体外培养对于进一步研究听觉异常是非常有意义的，是一种理想的耳科实验造模方法。

在进行体外培养试验时，一般采用小鼠作为实验对象，为了获得稳定的实验材料，需要对小鼠包含耳蜗毛细胞的螺旋器进行体外培养，因此快速获得体外培养细胞，并且可以在体外条件下保证螺旋器的生物活性非常重要。但小鼠耳蜗较小，进行细胞分离及培养难度较大。

现有的耳蜗螺旋器体外培养方法包含贴壁培养法和立体培养法，贴壁培养法更便于操作。然而现有的贴壁培养法仍存在诸多不足之处。原代细胞体外培养成功的第一步有赖于细胞是否及时贴壁生长。为使培养的细胞很好地贴覆于培养皿上，就必须在培养皿表面涂一层细胞外基质，在耳蜗螺旋器培养过程中，一般采用鼠尾胶包被培养皿，但是往往包被效果并不理想，因此本领域存在寻求更好包被基质的需求。此外，贴壁效果对于耳蜗螺旋器体外培养非常重要，其影响了毛细胞的生长状态、存活时间等指标，因此探索更好地提升贴壁效果、进而提高螺旋器细胞培养效果的包被基质是非常必要的。

对于贴壁用细胞外基质，在耳蜗螺旋器的体外培养中，各种基质的粘附效果不尽相同，而且基质本身也影响耳蜗螺旋器细胞的生长状态。需要筛选适合耳蜗螺旋器细胞粘附和生长的基质。本发明将鼠尾胶与纤维粘连蛋白、多聚鸟氨酸、多聚赖氨酸进行组合筛选，以期筛选出最适合耳蜗螺旋器体外培养的包被基质。

此外，在耳蜗螺旋器培养的培养过程中，仍需要保持细胞较好的贴壁和生长状态，添加适当培养物质作为补料非常有必要。对现有技术检索发现，凝血酶敏感蛋白-1(thrombin-sensitive protein，Thrombospodin-1，TSP-1) （序列信息见UniProtKB -P07996）主要存在于血小板α颗粒中，在许多正常细胞及肿瘤细胞中均有广泛的表达。TSP-1是一种重要的细胞外基质糖蛋白。TSP-1的生物学功能很复杂，有报道称在体内，TSP-1可以促进细胞的粘附、增殖、血管新生及肿瘤生长。但现有技术并没有公开或暗示TSP-1在体外对细胞培养的作用，特别是对于耳蜗螺旋器体外贴壁培养的作用。本发明通过实验发现，将TSP-1作为培养基补料成分，在体外培养小鼠耳蜗螺旋器时使用，可达到更好的细胞贴壁和生长状态更优效果，且进一步对细胞存活时间具有正向作用。

发明内容

针对如上所述现有技术中耳蜗螺旋器体外贴壁培养方法的不足，本发明的目的是提供一种改进的新生小鼠耳蜗螺旋器体外贴壁培养方法.

本发明一方面提供一种小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法，其特征在于，包含如下步骤：

（1）将小鼠断颈后剪开耳廓皮肤，顺外耳道挑除听泡，取出耳蜗，获得带前庭底座的小鼠耳蜗；