[发明专利]小鼠耳蜗螺旋器贴壁培养方法

权利要求书

1.一种小鼠耳蜗螺旋器的体外贴壁培养方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)将小鼠断颈后剪开耳廓皮肤，顺外耳道挑除听泡，取出耳蜗，获得带前庭底座的小鼠耳蜗；

(2)去除耳蜗顶后侧及顶转薄层骨壁，得到去除局部骨壁后的耳蜗，由耳蜗顶转至底转剥除耳蜗表面骨壁，可得去除外周骨质耳蜗膜迷路；

(3)去除螺旋韧带、血管纹、盖膜周边组织，去除耳蜗蜗轴的螺旋神经节，沿蜗顶螺旋向下，分段分离出基底膜，即得包含螺旋器的基底膜；

(4)培养：鼠尾胶以0.02mol/L的醋酸稀释50倍，与100μg/ml多聚鸟氨酸等体积混合，混合均匀，取适量加入到35mm培养皿中，使其淹没整个培养皿，然后在培养箱内放置1小时后，吸干培养皿内液体，再以PBS冲洗，自然晾干，备用；取适量无血清培养液加入到包被好的培养皿中，将步骤(3)分离得到的小鼠耳蜗基底膜移入，使其网状面朝上且平铺，下沉到培养皿底部，最后将培养皿缓慢移入37℃， 5％CO₂培养箱，进行培养，次日补加适量包含终浓度为5mM的TSP-1补料培养基，以后隔日更换补料培养基，总计培养10天；

步骤(4)中所述补料培养基为DMEM/F12培养液，添加体积百分比为1％的N2补料，体积百分比为2％的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素和终浓度为5mM的TSP-1；

步骤(4)中所述无血清培养基为DMEM/F12培养液，添加体积百分比为1％的N2补料，体积百分比为2％的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠是出生后3-5天的新生小鼠。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)在解剖显微镜下进行。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在耳蜗螺旋器的培养阶段，采用免疫染色标记Myo7a方法观察耳蜗基底膜螺旋器组织以及毛细胞活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫染色标记Myo7a方法包括：

1)将培养的耳蜗螺旋器移除培养液，加入2ml 4％的福尔马林固定液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

2)加入2ml 0.1％的PBS配制的Triton x-100溶液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

3)加入2ml 2.5％的PBS配制的BSA溶液，室温放置30分钟后用PBS洗去；

4)一抗孵育，其为Rabbit anti-Myo7a 1:200，2.5％BSA于PBS中，4℃过夜；

5)用PBS洗去一抗，加入二抗，其为Alexa Fluor 546goat-anti Rabbit IgG1:1000,2.5％BSA于PBS中，室温放置2小时；

6)用PBS洗去二抗，后用荧光显微镜进行观察、拍照。