[发明专利]一种非洲猪瘟病毒基因缺失株及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒基因缺失株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒基因缺失株是将非洲猪瘟病毒的CD2v基因缺失后得到的，所述非洲猪瘟病毒基因缺失株带有红色荧光标记基因。

2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒基因缺失株的原始毒株为基因II型的非洲猪瘟病毒毒株。

3.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株，其特征在于，所述原始毒株为华南地区分离的非洲猪瘟病毒毒株。

4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株，其特征在于，所述CD2v基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，缺失原始毒株基因组第73543位到74625位碱基。

5.一种如权利要求1-4任一所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)筛选表达盒的设计：以病毒vp72启动子序列，mRFP1序列，polyA序列为模板，设计合成RFP筛选表达盒，同时在表达盒的两端插入LoxP位点；

(2)同源重组供体质粒的构建：在步骤(1)得到的RFP筛选表达盒两端插入CD2v基因上下游片段，然后克隆入PUC57载体中，得到同源重组供体质粒；

(3)病毒的重组：同源重组供体质粒转染至猪骨髓巨噬细胞中，感染非洲猪瘟病毒原始毒株，采用荧光显微镜观察重组病毒感染细胞情况，挑取荧光细胞，冻融释放重组病毒，将该代重组病毒定义为P0代；

(4)重组病毒的纯化：将P0代重组病毒接种PAM细胞，经过有限稀释法筛选，扩大培养，通过PCR鉴定CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失株，以确定获得纯化的CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失株。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中同源重组供体质粒的序列如SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中PCR鉴定所用的引物包括检测CD2v基因的引物对和检测RFP基因的引物对，所述检测CD2v基因的引物对如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示，所示检测RFP基因的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

8.如权利要求1-4任一所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株在制备体外评价非洲猪瘟抗体水平的试剂中的用途。

9.如权利要求1-4任一所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株在制备体外筛选治疗非洲猪瘟的药物的试剂中的用途。

10.如权利要求1-4任一所述的非洲猪瘟病毒基因缺失株在制备非洲猪瘟疫苗中的用途。