[发明专利]一种抗冻蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种抗冻蛋白及其制备方法和应用，属于微生物抗冻蛋白技术领域。本发明通过对从北极海冰中分离获得的细菌BSI20414基因组序列分析发现一个巨型粘附蛋白，从该蛋白序列中预测出一个抗冻结构域，利用基因工程手段对该结构域序列进行克隆表达，获得可溶性重组蛋白，经活性研究发现，该重组蛋白具有较高抗冻活性，具有抑制冰晶生长与重结晶功能，在结构保护和细胞保护等方面具有应用潜力，为低温保护剂开发提供候选。

技术领域

本发明涉及微生物抗冻蛋白技术领域，具体涉及一种北极海冰细菌来源的抗冻蛋白及其在低温保护方面的应用。

背景技术

冰冻圈约占地球总表面积的13%，主要分布在南北两极及高山冰川等区域，绝大部分时间均处于零度以下低温。此外，地球上其他地区也会季节性经历低温冰冻，而冰冻会导致冰晶的形成，影响细胞渗透压并对细胞产生物理损伤，给生命带来致命损害。极地海冰是一类极端的海洋生境，其温度、盐度和营养物质梯度变化显著，且由于冰晶的存在，对生存其中的生命而言极具挑战。由于特殊适应机制，海冰微生物得到科研和工业应用领域广泛的关注(Wang, Salem et al. 2019)。其中，抗冻蛋白便是一种重要的低温生存机制，不仅具有重要的研究价值，而且在生产实践中具有广泛的应用空间。

抗冻蛋白是一类能够与冰晶吸附结合而改变冰晶生长状态、抑制重结晶的蛋白质，能非依数性降低溶液冰点，具有热滞活性、抑制冰重结晶性、修饰冰晶形态等特性（Białkowska et al., 2020）。抗冻蛋白作为新型低温保护剂，在低温生物行业、食品、农业等领域的应用潜力巨大。随着低温生物技术、转基因技术等的快速发展，亟需对稀有菌毒种资源、人类细胞、器官和组织，以及各类种质资源实现高质量保存，就需要探索安全、高效、绿色的低温保护剂方案。因此，获得廉价、功能优良、具有生产潜力的抗冻蛋白意义重大。

研究最早也最成熟的是动物来源的抗冻蛋白，例如鱼类抗冻蛋白和昆虫抗冻蛋白。抗冻蛋白最先由加拿大科学家从南极海域中一种名为Nototheneniid的鱼类血清中分离（Devries and Wohlschlag, 1969）。在植物中也发现存在抗冻蛋白，但活性不如昆虫抗冻蛋白。细菌抗冻蛋白的发现比动物抗冻蛋白晚了近30年，目前对细菌抗冻蛋白的认识还不是很清楚，但细菌抗冻蛋白的优势明显，例如具有高度多样性、来源广泛、活性较好、克服了鱼类抗冻蛋白的腥味、以及来源可持续、成本低且适合工业放大生产。因此，细菌抗冻蛋白逐渐成为抗冻蛋白的重要研究和开发应用对象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑制冰晶形成以及重结晶活性的抗冻蛋白，将其应用于细胞的低温保护，为细胞低温保护剂开发提供候选。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过对从北极海冰中分离获得的细菌BSI20414基因组序列分析发现一个巨型粘附蛋白，从该蛋白序列中预测出一个结构域，跟已知的M. primoryensis的抗冻蛋白结构域氨基酸序列相似性86.5%。利用基因工程手段对该结构域序列进行克隆表达，获得可溶性重组蛋白，经活性研究发现，该重组蛋白具有较高抗冻活性，浓度为1 mg/ml时热滞活性为-0.15℃。

因此，本发明提供了一种抗冻蛋白，由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或插入一个或多个氨基酸所获得的具有同等活性的蛋白质。

具体地，可通过现有的体外表达体系对所述抗冻蛋白进行生产制备，例如大肠杆菌表达系统。

本发明提供了一种编码所述的抗冻蛋白的基因序列，所述编码基因包含核心序列，所述核心序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

具体地，将所述核心序列克隆到表达质粒中，利用表达质粒携带的起始密码子、终止密码子实现抗冻蛋白的表达。表达质粒自身携带的标签序列使得表达出的融合蛋白中携带标签，有助于重组蛋白的分离纯化。