[发明专利]水溶性荧光染料偶联物的纯化方法

说明书

本发明公开了水溶性荧光染料偶联物的纯化方法。该方法包括：对待纯化样品依次进行阴离子交换层析纯化和反相制备液相色谱纯化，得到纯化产品。该方法结合阴离子交换层析法与反相制备液相色谱法对水溶性荧光染料偶联物进行纯化，可在有效降低样品损耗的同时，显著提高样品的纯化效果，且易于实现规模化生产。

技术领域

本发明涉及物质分离纯化技术领域，具体而言，本发明涉及水溶性荧光染料偶联物的纯化方法。

背景技术

物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给物质分子，分子被激发，处于激发态的分子不稳定，可通过辐射跃迁的衰变过程而返回基态，衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光。一些能产生荧光的物质运用到生物染色剂中，我们称之为荧光染料(dye)。荧光染料被广泛用于蛋白、抗体、核酸及其他生物分子的标记和检测。一般将水溶性荧光染料连接一段连接臂(linker)(如PEG等)然后连接到基因芯片上，应用于基因测序。也可以利用共价键将染料与连接臂相连，然后连接到寡核苷酸上形成特异性的荧光探针。连接臂一般含有三个以上的碳原子，三个碳原子以上的连接臂可以使荧光染料与核苷酸或蛋白保持一定的距离，从空间上不会阻碍杂交或酶催化过程。为了生物检测方面的应用更加方便，常常在染料的结构上引入羟基、羧基以及磺酸基等强极性基团，这在提高染料水溶性的同时使得产物与副产物间的极性差异减小，从而增大了后续分离纯化的难度。为了确保标记和检测结果的准确性以及满足各类标记和检测的需求，短时间内，制备获得高纯度荧光染料偶联物(dye-linker)成为了制约基因测序和荧光探针行业发展的瓶颈。

目前，常用的荧光染料偶联物的纯化方法是利用传统的硅胶柱、硅胶板或反相制备液相。传统硅胶柱是正相柱，适合极性较小或极性一般的化合物的纯化。对于水溶性较好或极性较大的化合物易出现不可逆吸附，因此会有部分样品浪费。此外，该方法会用到甲醇、二氯甲烷等有机溶剂作为洗脱剂，此类溶剂存在一定毒性，不够环保。制备硅胶板常用于小量样品的制备，难以实现规模化生产。而如果仅用反相制备液相分离纯化，在保证较高纯度的条件下，纯化通量会受到影响；提高纯化通量则难以获得高纯度的样品。因此，开发出一套快速制备高纯度荧光染料偶联物的纯化方法已迫在眉睫。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出水溶性荧光染料偶联物的纯化方法。该方法结合阴离子交换层析法与反相制备液相色谱法对水溶性荧光染料偶联物进行纯化，可在有效降低样品损耗的同时，显著提高样品的纯化效果，且易于实现规模化生产。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种水溶性荧光染料偶联物的纯化方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对待纯化样品依次进行阴离子交换层析纯化和反相制备液相色谱纯化，得到纯化产品。

根据本发明上述实施例的水溶性荧光染料偶联物的纯化方法，首先对待纯化样品进行阴离子交换层析纯化。不同化合物所带电荷存在差异，因而在阴离子交换树脂上是吸附能力不同。由此，通过阴离子交换层析纯化，可除去样品中的大部分杂质。同时，阴离子交换树脂的洗脱剂是水和盐溶液，水溶性荧光染料偶联物在此体系中的溶解性较好，可以减少产品的损耗，也避免了有机溶剂的使用，减少了污染。此外，阴离子交换层析法可以规模化生产，一次纯化量可高达10g或者更多。后续，将阴离子交换树脂纯化后的样品进行反相制备液相色谱纯化，因样品杂质较少，分离原理与阴离子交换层析法互补，可在较短的分析时间内将样品的纯度提高到99％以上，从而实现在较短的时间内获得大量高纯度的荧光染料偶联物产品。同时，由于荧光染料偶联物具有极性较大的特点，可以在较低比例的有机相中出峰，从而减少了反相制备液相色谱纯化中有机溶剂的使用。另外，水溶性荧光染料偶联物在阴离子交换树脂和反相制备液相色谱填料中均无不可逆吸附，纯化样品的产率也能够得到保证。

另外，根据本发明上述实施例的水溶性荧光染料偶联物的纯化方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述阴离子交换层析纯化所采用的阴离子交换树脂为DEAE树脂。