[发明专利]一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，包括如下步骤：步骤1：将肝癌组织标本的表面清洗并去除脂肪组织；步骤2：将组织剪成小块接种到孔板中并采用初级培养基培养；步骤3：待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板达一定数量后，将肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞混合接种并加入加入全培养基中培养；步骤4：培养至饲养细胞至少部分死亡后，收集细胞冻存，得到肿瘤浸润淋巴细胞。该方法快速可靠且性价比高，经过本发明的方法能够在较短时间内获得足够数目的淋巴细胞，同时这些淋巴细胞亦具有相当的活力，可用于ACT等细胞治疗，为CAR‑T、TCR‑T等治疗方法提供良好基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法。

背景技术

肝癌是世界第四最常见肿瘤相关死亡原因，其五年生存率只有18％，是第二最常见致死肿瘤，仅次于胰腺癌。肝癌中有接近90％的病理类型为肝细胞癌，常见的发病危险因素为：肝硬化、年龄、种族、性别以及肝脏损害程度，乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染已成为肝癌发病的两个重要原因之一。肝癌患者通常合并分子病理学的改变，接近30％早起肝癌患者存在免疫活化，但于此同时，亦有25％患者没有免疫浸润。早期肝癌可选择肿瘤消融术、手术切除、肝移植等治疗方式，但晚期肝癌患者可供选择的方案不多，常见的一线用药未索拉非尼和仑伐替尼，虽然同时亦有许多临床试验在进行中，但效果差强人意。因此，开发新的肝癌治疗方法尤为重要。

肿瘤免疫治疗现正成为研究热点，ACT(Adaptive cell transfer)疗法为肿瘤晚期病人带来一线希望。但体外淋巴细胞的培养、扩增以及如何能在短时间内获得足够数目的可以用于治疗的细胞一直是个难题。

本申请比较了手动研磨肿瘤组织和机器研磨肿瘤组织后使用淋巴细胞分离液和CD45磁珠纯化后培养肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)，以及单纯组织块爬出细胞培养TIL等各种不同方法，旨在发现一种快速可靠且性价比高的体外培养TIL的方法，在较短时间内获得足够数目的淋巴细胞，同时这些淋巴细胞亦具有相当的活力，可用于ACT等细胞治疗，为CAR-T、TCR-T等治疗方法提供良好基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，该方法快速可靠且性价比高，经过本发明的方法能够在较短时间内获得足够数目的淋巴细胞，同时这些淋巴细胞亦具有相当的活力，可用于ACT等细胞治疗，为CAR-T、TCR-T等治疗方法提供良好基础。

在详细描述本发明的方法之前，对本文涉及的相关技术名词予以解释：

肿瘤浸润淋巴细胞：tumor-infiltrating lymphocyte,TIL；

rhIL-2：重组人白介-素2；

HEPES：Good’s缓冲试剂,中文全称为N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；

RMPI-1640：Roswell Park Memorial Institute洛斯维·帕克纪念研究所1640培养基；

OKT3：抗人成熟T细胞共同分化抗原CD3的单克隆抗体；

PBS：磷酸缓冲盐溶液。

本发明提供的技术方案为：一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，包括如下步骤：

步骤1：将肝癌组织标本的表面清洗并去除脂肪组织；

步骤2：将组织剪成小块接种到孔板中并采用初级培养基培养；

步骤3：待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板达一定数量后，将肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞混合接种并加入加入全培养基中培养；