[发明专利]一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法

权利要求书

1.一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将肝癌组织标本的表面清洗并去除脂肪组织；

步骤2：将组织剪成小块接种到孔板中并采用初级培养基培养；

步骤3：待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板达一定数量后，将肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞混合接种并加入加入全培养基中培养；

步骤4：培养至饲养细胞至少部分死亡后，收集细胞冻存，得到肿瘤浸润淋巴细胞；

其中初级培养基中含10％人AB血清、6000U/ml rhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、RMPI-1640；

所述全培养基中含10％人AB血清、500U/ml rhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mM HEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ng/ml OKT3、RMPI-1640。

2.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3的培养条件均为：在孵箱中以37℃，5％CO₂培养。

3.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤2中的组织剪成1～2mm³大小的小块，孔板为24孔板。

4.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤3中，待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板不少于10⁵个细胞后进行后续操作。

5.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤2和步骤3之间，需要每隔1日更换初级培养基。

6.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤3中，肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞的比例为1:100。

7.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤3中接种于24孔板，所述步骤3和步骤4之间还包括：

隔日观察细胞并进行换液，待镜下可见一定量的肿瘤浸润淋巴细胞增殖团时，进行传代处理；

经传代处理，待肿瘤浸润淋巴细胞长满2个24孔板的孔时，转到6孔板中，并隔日使用全培养基换液。

8.根据权利要求1所述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，其特征在于，所述步骤4在步骤1之后10天进行。