[发明专利]一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统，该系统由三部分组成：第一部分是利用LbCas12a基因编辑系统改造得到的缺失了IPI和IPII基因的T4突变噬菌体；第二部分是表达CRISPR‑LbCas12a基因编辑载体的宿主菌，所述CRISPR‑LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR‑LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列；第三部分是用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒。本发明还公开了该系统的构建方法及其应用。将蛋白包装到噬菌体衣壳内，能够避免其受外界环境的影响，提高蛋白的稳定性，同时也可做为蛋白运送载体，具有较高的应用价值。本发明提供了一种简单高效的方法，能将目标蛋白高密度包装到T4噬菌体衣壳内腔。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于将目标蛋白高密度包装在T4噬菌体衣壳内腔的包装系统，本发明还涉及该包装系统的构建方法和应用。

背景技术

T4噬菌体是一种特异感染大肠杆菌的烈性噬菌体，病毒粒子由头部和尾部组成。头部蛋白质衣壳包裹着病毒的双链基因组DNA，主要由gp23、gp24、Soc和Hoc等4种蛋白组成，其中HOC和SOC是非必需蛋白。敲除Hoc和Soc(Hoc^-Soc^-T4)不影响T4噬菌体的增殖，且重组的Hoc和Soc蛋白在体外能特异地结合Hoc^-Soc^-T4衣壳。因此，外源蛋白与 HOC或SOC融合后，能高密度展示在Hoc^-Soc^-T4噬菌体衣壳表面。T4噬菌体是目前已知的唯一能够高密度展示完整外源蛋白的噬菌体，具有巨大的应用潜力。

除了展示在衣壳表面外，外源蛋白还能被包装到T4噬菌体的衣壳内腔。这主要得益于 T4噬菌体独特的衣壳特征，即衣壳内腔内除了含有病毒基因组外，还包装了一些蛋白分子。 T4噬菌体的衣壳组装起始于内核支架(internal core scaffold)，它是一种蛋白核团，主要由gp21、gp22、alt和三种非必需内部蛋白(Internal Protein，即IPI、IPII和IPIII)组成，其中gp21具有丝氨酸蛋白酶活性。T4噬菌体的主要衣壳蛋白gp23和gp24围绕内核支架组装，形成衣壳前体(procapsid)。衣壳前体能够激活gp21的蛋白酶活性，从而将大部分内核支架蛋白切割成短肽并释放出衣壳，为后续基因组DNA包装提供空间。IPII和IPIII 的N端均有一段10个氨基酸的保守序列，称为CTS(Caspid Targeting Sequence)，它负责引导IPII和IPIII蛋白到内核，与其它内核支架蛋白一起形成内核支架。在实验室条件下IPI、 IPII和IPIII是非必需的，即敲除这些基因不影响T4噬菌体增殖。研究表明，N端融合了 CTS的外源蛋白能够被引导到内核，进而被包装到T4噬菌体衣壳内腔，但衣壳内腔仅能包装有限数量的外源蛋白。

T4噬菌体衣壳表面可以高密度展示外源蛋白，衣壳内也可以包装高浓度外源DNA，是一种非常好的纳米材料，具有巨大的应用潜力。本发明提供了一种能将外源蛋白高密度包装到T4噬菌体衣壳内腔的便捷方法，进一步提升T4噬菌体衣壳的应用潜力。由于T4 噬菌体内核支架大小较为恒定，含有IPI、IPII和IPIII三种非必需内部蛋白，因此，用外源蛋白代替这三种非必需蛋白，与gp21、gp22、alt等形成内核支架，衣壳蛋白gp23和gp24 在围绕内核支架组装时就能将更多的外源蛋白包装到T4衣壳内。活化的gp21蛋白酶仅会切割CTS序列，不会降解外源蛋白。本发明基于实验室近期开发的新型噬菌体基因组编辑技术(LiuYuepeng等.Journal of Virology,2020.94:e01630-20)，敲除野生型T4噬菌体的IPI 和IPII基因，构建了T4ΔIPIΔIPII突变体；构建了表达特异切割T4ΔIPIΔIPII噬菌体的IPIII 基因的CRISPR-LbCas12a的大肠杆菌工程菌；构建了用于将IPIII基因替换成目标基因的供体质粒载体。在包装外源目标蛋白时，只需将其编码基因克隆到供体质粒中并转化到大肠杆菌工程菌，然后用T4ΔIPIΔIPII噬菌体感染，就可以将外源目标蛋白高密度包装到T4 噬菌体衣壳内腔。