[发明专利]一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统及其构建方法和应用有效
申请号: | 202110279433.5 | 申请日: | 2021-03-16 |
公开(公告)号: | CN113061620B | 公开(公告)日: | 2022-09-13 |
发明(设计)人: | 陶攀;郭鹏举;柳月鹏 | 申请(专利权)人: | 华中农业大学 |
主分类号: | C12N15/70 | 分类号: | C12N15/70;C12N15/64;C12N7/00;C12N1/21;C12P21/06;C12R1/19 |
代理公司: | 武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙) 42231 | 代理人: | 徐绍新 |
地址: | 430070 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 t4 噬菌体 衣壳内腔 目标 蛋白 包装 系统 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统,其特征在于包含三个部分:第一部分是利用LbCas12a基因编辑系统改造得到的缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体;第二部分是含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌,所述CRISPR-LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR-LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列;第三部分是用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒,其中,
所述IPI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;
所述IPII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;
所述IPIII基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述IPIII基因的靶向序列如SEQ ID NO.4所示。
2.如权利要求1所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法,其特征在于包括以下步骤:
1)利用LbCas12a基因编辑系统改造T4噬菌体,得到缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体;
2)构建一种靶向T4噬菌体IPIII基因的CRISPR-LbCas12a基因编辑载体,转化至宿主菌,得到含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌,所述CRISPR-LbCas12a基因编辑载体在宿主菌内表达产生的CRISPR-LbCas12a蛋白复合体能特异性切割所述缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体的IPIII基因的靶向序列;
3)利用一步克隆法将线性化pUC19载体、目标蛋白编码序列、IPIII基因上下游同源臂连接在一起,得到用于将T4噬菌体IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒。
3.如权利要求2所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法,其特征在于:所述供体质粒含有T4噬菌体衣壳靶向序列,该序列如SEQ ID NO.6所示。
4.如权利要求2所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法,其特征在于,所述利用LbCas12a基因编辑系统改造T4噬菌体,得到缺失IPI和IPII基因的T4突变噬菌体的具体方法如下:
1)构建靶向T4噬菌体IPI基因的LbCas12a基因编辑载体,命名为LbCas12a-IPI;构建靶向T4噬菌体基因组IPII基因的LbCas12a基因编辑载体,命名为LbCas12a-IPII;
2)构建用于缺失IPI基因的供体质粒,命名为pMD18-T-IPI;构建用于缺失IPII基因的供体质粒,命名为pMD18-T-IPII;
3)将1)和2)中的LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒转化至宿主菌,得到含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的宿主菌;将1)和2)中的LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒转化到宿主菌,得到含有LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的宿主菌;
4)用野生型T4噬菌体感染上述含有LbCas12a-IPI和pMD18-T-IPI质粒的宿主菌,得到缺失IPI基因的突变体,命名为T4ΔIPI;
5)用T4ΔIPI噬菌体感染上述含有LbCas12a-IPII和pMD18-T-IPII质粒的宿主菌,得到缺失IPI和IPII基因的突变体,命名为T4ΔIPIΔIPII。
5.如权利要求4所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法,其特征在于:所述LbCas12a-IPI基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;所述LbCas12a-IPII基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.如权利要求4所述T4噬菌体衣壳内腔目标蛋白包装系统的构建方法,其特征在于:所述pMD18-T-IPI供体质粒的同源臂序列如SEQ ID NO.9所示;所述pMD18-T-IPII供体质粒的同源臂序列如SEQ ID NO.10所示。
7.权利要求1所述的包装系统用于将目标蛋白包装在T4噬菌体衣壳内腔的用途。
8.一种利用权利要求1所述的包装系统将目标蛋白包装在T4噬菌体衣壳内腔的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将所述用于将IPIII基因替换成目标蛋白基因的供体质粒转化到所述含有CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌,得到含有供体质粒和CRISPR-LbCas12a基因编辑载体的宿主菌;
2)用缺失IPI和IPII基因T4突变噬菌体感染上述含有两种质粒的宿主菌,得到衣壳内腔包装有目标蛋白的重组T4突变噬菌体。
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