[发明专利]一种微生物酶制剂的制备方法

说明书

一种微生物酶制剂的制备方法，特别是提供一种细菌液体发酵法制备微生物酶制剂的方法，采用膜浓缩过滤的方法，并加入洗涤液除去发酵液中的小分子可溶性杂质和无机盐，再经过匀浆破壁、分离提纯及冻干，得到相应的粗制酶制剂或精制酶制剂。该方法工艺简单，设备投资低，操作方便，适用于工业化大规模生产。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是提供了一种微生物酶制剂的制备方法。

背景技术

酶是由活细胞产生的，对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质。酶作为一种生物催化剂，具有高效性、专一性、反应条件温和等特点，广泛应用于食品、纺织、医药卫生、能源开发、环境工程、化工等各个生产领域。

酶的种类繁多，来源及用途各不相同，因而对酶制品的纯度要求也不同。工业上用酶有的只需要粗制品，一般无需高度纯化，如洗涤剂用的蛋白酶，只需经过简单的提取分离即可。食品工业用酶，则需经过适当的分离纯化，以确保安全和卫生。医药用酶，特别是注射用酶及分析测试用酶，则需要经过高度的分离纯化过程。

酶的制备主要有两种方法，即直接提取法和微生物发酵生产法。早期酶制剂是以动植物作为原料，从中直接提取获得。由于动植物生长周期长，有受地理、气候和季节等因素的影响，原料来源受到限制，一般不适用于大规模工业化生产。目前，人们越来越多地转向以微生物作为酶的主要来源。

采用微生物发酵法制备酶，具有很多优势：①微生物种类繁多，几乎自然界中存在的所有酶，都可以在微生物中找到。②微生物生长繁殖快，生活周期短，因而酶的产量高。③用于培养微生物的原料来源丰富，价格低，酶的制备成本低。④可以通过诱变等方法培育出高产菌种。⑤结合基因工程、细胞工程等现代生物技术手段，可以完全按照人类的需要使微生物产出目的酶。

由于微生物发酵法生产酶具有以上独特优点，目前工业上使用的酶制剂，绝大多数来自于微生物，如淀粉酶类的α一淀粉酶、β一淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及异淀粉酶等都是从微生物中生产的。

尽管微生物发酵法生产酶制剂存在上述优点，但仍存在一些问题需要解决。①消除毒性：微生物发酵法生产的酶制品中会带有一些细菌自身的生理活性物质，这些生理活性物质往往对人体有害，因此需要更高的分离纯化技术以保证安全。②优良产酶菌种的筛选培育：大多数工业微生物制酶生产采用的菌种较少，目前仅局限于11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。只有不断寻找更多的适用的产酶菌种，才可能使越来越多的酶采用微生物发酵法进行工业化生产。

酶的微生物发酵生产方式有两种，一种是固体发酵法，另一种是液体发酵法。

固体发酵法是利用麸皮和米糠为主要原料，添加谷糠、豆饼等，加水搅拌成半固体状态，供微生物生长和产酶，主要用于真菌来源的商业酶的生产。其中用米曲霉生产淀粉酶，以及用曲霉和毛霉生产蛋白酶在中国和日本已有悠久的历史。

液体发酵法又分液体表面发酵和液体深层发酵法两种。其中液体深层发酵法是现在普遍采用的方法。以细菌为来源的酶的工业化生产均采用此种方法。

细菌液体发酵法得到的细菌培养液，多采用离心设备分离菌体，如专利CN110527673A葡萄糖脱氢酶的制备方法中基因工程菌（大肠杆菌）培养液通过离心设备分离菌体。专利CN110819610A极耐热甘露聚糖酶基因工程菌（大肠杆菌BL21）培养液采用离心收集菌体，专利CN108315315A制备阿魏酸脱羧酶的方法，将产阿魏酸脱羧酶的微生物培养，得细胞培养液，离心，制得菌体细胞。

使用离心设备处理微生物培养液的方法适用于实验室小规模处理，工业放大规模比较困难，操作复杂，收率低，具有一定的局限性。

发明内容