[发明专利]一种抗菌肽GK-19和FK-20及其制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种抗菌肽GK‑19和FK‑20及其制备方法及应用。本发明的抗菌肽GK‑19,其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明的抗菌肽FK‑20,其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明具有分子量小、人工合成方便，杀菌作用强、抗菌谱广等优点，此外GK‑19和FK‑20有效浓度区间无溶血效应，对包括人正常肝细胞、人胚肾细胞、人脐静脉内皮细胞及大鼠肺动脉血管平滑肌细胞均无明显毒性。此外，动物实验结果表明其活体安全性较高。

技术领域

本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及两种抗菌肽序列GK-19和FK-20的序列设计、多肽人工合成及纯化，以及其在制备抗菌药物中的用途。

背景技术

近几十年来，由于全球过度滥用或乱用抗生素，导致越来越多耐药菌甚至超级细菌的出现。然而，目前抗生素的研发成本高，且研发周期远久于耐药菌的繁殖速度，新型抗生素的数量也在不断减少，因此，寻找一种可替代抗生素且不易产生耐药性的新型抗菌剂，以应对目前面临的细菌耐药性上升的巨大困境就显得尤为重要。

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是动植物体内的一种天然“防御武器”，目前已在植物、昆虫、鱼类、鸟类、哺乳动物、真菌、细菌等体内发现了上千种抗菌肽。这些具有天然抗生素之称的抗菌肽对革兰氏细菌有较强的杀伤作用，其杀菌机制复杂，但大多数理论都认为带有阳离子的抗菌肽可以直接与带负电的细菌细胞膜结合，使其细胞膜通透性增加从而导致细菌死亡，或者通过在细胞膜形成孔洞，使膜内物质流出而导致细胞死亡，或者作用于细胞内的蛋白质、核酸来杀死细胞，但对宿主细胞的毒性极低。

近年来，抗菌肽的多种生物活性逐渐得到确认，其抗细菌、抗真菌、免疫调节、抗癌细胞、抗病毒和抗寄生虫等作用在医药领域具有广泛的应用前景。抗菌肽取代抗生素已逐渐成为可能，与抗生素相比，抗菌肽的优势在于它具有更广泛的抗菌谱和高效的抗微生物活性，通过不同的作用机制，对细菌、真菌、寄生虫和病毒等均有抑制和杀灭作用。除了对微生物的作用外，抗菌肽在一定程度上可以促进巨噬细胞、淋巴细胞等的增殖，影响免疫系统的作用，抗菌肽甚至可以通过刺激血管生成来中和革兰阴性菌产生的内毒素，对传统抗生素耐药的微生物可以在抗菌肽的作用下快速和直接的被清除。

抗菌肽的安全性和稳定性是医药领域开发应用面临的挑战，随着人们对其抗菌机制的进一步认识和新的抗菌肽的发现，如今人们不仅可以从生物体内直接分离纯化得到抗菌肽，也可以对原有的天然抗菌肽进行结构改造或重新设计，比如更换某些氨基酸残基或根据需要直接设计抗菌肽氨基酸的一级结构，以期获得活性更高、更有针对性同时对宿主细胞无毒害作用的抗菌肽。

此外，截止2018年，依据抗菌肽数据库，目前共有4849个抗菌肽，其中包含4256个天然多肽和593个人工合成多肽。其中大约有70个多肽有望作为生物医药。在这70个抗菌肽中，有34个处于临床前研究阶段，27个处于临床研究阶段，有10个多肽在临床二期或者三期实验中失败了。目前已有一种抗菌肽(达托霉素，礼来公司)获FDA批准可作为抗生素。蝎毒液已被证明是一个丰富的抗菌肽的来源，实验证明，这些抗菌肽均可以杀死革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌、病毒和肿瘤细胞。其中AamAP1是从北非蝎Androctonus amoeruxi中分离出来的一种新型宿主防御肽，因其膜破坏性的抗菌机制，以及对革兰氏阳性菌的广谱抗菌作用，有望成为解决耐药微生物感染的有力武器，然而AamAP1在使用过程中存在以下缺点1、只对革兰氏阳性菌有杀伤作用，且杀菌能力较弱，最小抑菌浓度150μM；2、天然AamAP1获取困难且纯度非常低；3、在生物体内稳定性差，半衰期2h。这些都极大的限制了其临床应用前景。因此，直接模拟天然蝎毒抗菌肽正电性与两亲性的独特结构，人工设计并合成同样具有广谱抗菌活性的衍生抗菌肽是个良好的解决方案。

发明内容

为解决背景技术中存在的上述问题，本发明提供了两种抗菌肽序列GK-19和FK-20的序列设计、多肽人工合成及纯化，以及其在制备抗菌药物中的用途。