[发明专利]一种鉴别灵芝属真菌的候选DNA条形码、引物及方法

说明书

本发明公开了一种鉴别灵芝属真菌的候选DNA条形码、引物及方法，所述引物包括6条序列，一次PCR扩增得到DNA条形码序列SSU+ITS+LSU片段，引物退火温度为60℃，扩增目的片段约3000个碱基对，扩增片段应用包括基于Genebank Blast比对的灵芝属真菌鉴定和灵芝分子系统发育学分析。本发明所述引物具有扩增灵芝属真菌的特异性、扩增率高、鉴定准确的优点。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定灵芝属真菌的方法，具体为一种鉴别灵芝属真菌的候选DNA条形码、引物及方法。

背景技术

灵芝是中国名贵中药材，又称仙草、瑞草、万年茸等。灵芝在我国有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。灵芝富含灵芝多糖，三萜类，甾醇，氨基酸，蛋白质等600余种成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗辐射等功效，用于治疗癌症，糖尿病，高血压，失眠、厌食症、关节炎、哮喘、支气管炎、胃炎、高胆固醇、红斑狼疮等疾病。《中国药典》将灵芝和紫芝收录其中，认为灵芝是无毒，安全的药物。

灵芝属(Ganoderma P.Karst.)隶属多孔菌目(Polyporales)灵芝科(Ganodermataceae)，据分类研究报道，全世界有灵芝400余种，中国发现80余种。在古代中国，人们根据颜色将其分为青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、云芝六类。民间常做药用的芝类均以“灵芝”称呼，实则包括欧洲灵芝、四川灵芝、松杉灵芝、紫芝、薄灵芝、树舌灵芝、血芝等10余个灵芝种类，其中有四川灵芝和紫芝最为常见。

中国灵芝物种多样性丰富，不同的灵芝种类含有的药用成分各异。然而，灵芝种类的鉴定区分非常困难，原因一是灵芝在形态上极为相似，难以根据形态鉴定区分；二是以DNA条形码等分子手段鉴定必须要以高质量的DNA为前提，市售灵芝在保存过程中极易附带其它真菌或者被重寄生真菌污染，三是DNA条形码SSU、ITS、LSU的获得，如以传统方法的PCR扩增需要通过多个反应，耗时耗力且不经济。本发明提出一个可靠、简便、快速有效的灵芝鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是获得一种鉴定灵芝属真菌的候选DNA条形码、引物及方法，利用灵芝属真菌核糖体的DNA遗传信息，对灵芝属真菌进行准确鉴定。

本发明的技术方案：一种鉴别灵芝属真菌的候选DNA条形码、引物及方法，所述引物对及其序列为：3214F:CGCCGCTCCATTGGTGATT，3312F:GCAATCAAGCCCCGACTTCC，3294F:ACATGCAATCAAGCCCCGAC，3588F:GCAATCAAGCCCCGACTTCC，3294R:CACTTAAACGCTGACGGCGA，3588R:TCTTCACTGACCTCCACGCC。

所述引物在灵芝属真菌鉴定中应用。

所述灵芝真菌鉴定需要主要仪器包括PCR仪，主要试剂包括引物、dNTP、MgSO₄、超高保真DNA聚合酶、反应缓冲液，主要软件工具包括Bioedit、MEGA。

所述灵芝鉴定的步骤包括：

⑴提取灵芝属真菌的基因组。

⑵以步骤⑴提取的基因组为模板，以混合的正向引物3214F、3312F、3294F、3588F和混合的反向引物3294R、3588R为扩增引物，进行如下的反应体系配制和反应程序：

反应体系

反应程序

⑶取PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

⑷测序获得序列片段的Blast比对鉴定和系统发育学分析。