[发明专利]一种发酵法制备微生物源壳寡糖的方法

权利要求书

1.一种发酵法制备微生物源壳寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)：曲霉发酵：将曲霉斜面孢子转接于种子液中培养，再将培养好的种子液转接于发酵培养基中培养，进行曲霉发酵；所述发酵所用的曲霉为赭曲霉，其分类命名为赭曲霉，拉丁文名称为Aspergillus ochraceus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，即CGMCC，菌种保藏编号为：CGMCCNo.15668，保藏日期为：2018年04月25日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

步骤2)：地衣芽孢杆菌发酵：向步骤1)得到的曲霉发酵液中补加已灭菌的营养液，搅拌均匀，调节发酵液pH至5.5-7，再于无菌操作下接入5-30g/L地衣芽孢杆菌粉，继续发酵；

步骤3)：乳酸菌发酵：向步骤2)得到的发酵液于无菌操作下接入5-20g/L的乳酸菌粉，继续发酵，即获得含有壳寡糖的液体发酵物；

步骤4)：除渣除菌处理：将步骤3)获得的含有壳寡糖的液体发酵物，在搅拌状态下加入固体氢氧化钙调节pH至6.5-7.5，过滤除渣除菌，得到含有壳寡糖的澄清透明液体；

步骤5)：吸附处理：将步骤4)获得的液体用氢氧化钠溶液调节pH至8.0-10.5，按照固液质量比1:10-1:30，加入弱碱性离子交换树脂，进行吸附，吸附结束后过滤去除树脂，调节溶液至中性，获得壳寡糖溶液；

步骤6)：醇沉干燥处理：向步骤5)获得的壳寡糖溶液中加入其3-4倍体积的无水乙醇搅拌均匀，静置过夜后取沉淀，沉淀用乙醇溶液洗涤4-6次，置于冷冻干燥机中干燥，获得白色雪花状壳寡糖固体粉末。

2.如权利要求1所述的发酵法制备微生物源壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤1)中种子液的制备方法为：将菌种于无菌操作下吸取0.1-0.12mL并均匀涂布于斜面培养基中，27-30℃恒温培养4-6天，得到发酵所需要的菌种，于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，制备得到孢子浓度为4.0×10⁸-7.0×10⁸个孢子/mL的孢子悬液；按照10-15wt％的接种量将孢子悬液转接于种子培养基中，于27-30℃恒温摇床中170-200rpm培养24-30h；将种子液按照10-15wt％的接种量，无菌操作下转接于发酵培养基中，在温度27-30℃，转速100-450rpm，通气比为0.4v/v/min-1.6v/v/min条件下培养36-48h，然后升温至45-65℃，并用氢氧化钠溶液调节pH至6.0-8.0，保温搅拌12-24h。

3.如权利要求2所述的发酵法制备微生物源壳寡糖的方法，其特征在于，所述斜面培养基的原料包括以重量份数计的去皮马铃薯200-220份，葡萄糖20-25份，琼脂20-23份及加水1000份，其pH值为6-6.8，并于121℃湿热灭菌30min；所述的种子培养基的原料包括以重量份数计的蔗糖8-15份，酵母粉8-15份，糖蜜2-8份及加水1000份，其pH值为6-7，并于121℃湿热灭菌30min；所述的发酵培养基的原料包括以重量份数计的蔗糖20-30份，可溶性淀粉10-20份，酵母粉5-10份，黄豆粉8-15份，糖蜜1.5-4份，乙酸钠0.1-1份及加水1000份，其pH值为5.5-7，并于121℃湿热灭菌30min。

4.如权利要求1所述的发酵法制备微生物源壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤2)中补加的营养液包括以重量份计的葡萄糖17.5-70份，NaCl 0.35-2.8份，K₂HPO₄ 0.6-1.8份，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.9份，FeSO₄·7H₂O 0.01-0.04份，CaCl₂0.1-1.0份及加水200份，营养液配置好后，于121℃湿热灭菌30min，冷却后待用。

5.如权利要求1所述的发酵法制备微生物源壳寡糖的方法，其特征在于，所述步骤2)中地衣芽孢杆菌发酵的条件为：发酵时间12-24h，发酵温度33-39℃，转速100-350rpm，通气比0.2v/v/min-1.0v/v/min。