[发明专利]犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法

说明书

一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括：1)查找犬流感病毒CIV、犬冠状病毒CCOV和犬呼肠孤病毒CRV的保守区序列；2)根据GenBank上公布的CIV病毒的M基因、CCOV病毒的L1基因和CRV病毒的M基因序列信息，分别设计上下游引物对；3)进行三重PCR反应，反应体系中，引物为2.5‑5μmol/L，模板量为1‑5ng/μL，其中，3组引物的添加量符合扩增CIV病毒的引物：扩增CCOV病毒的引物：扩增CRV病毒的引物＝1：0.5‑1：1。利用本发明，可对单一样品同时进行三种不同病原的检测，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，以方便快速、准确地进行相关流行病学监测。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法。

背景技术

随着人民生活水平的提高及伴侣动物概念的植入，宠物数量剧增，宠物犬作为家庭的一员，在带来生活慰藉的同时，由于时刻与人类的近距离接触，为许多人兽共患病交叉传播提供了条件，极大地增加了公共卫生安全隐患。此外，流浪犬居无定所，生活环境恶劣，更没有开展定期的清洁、免疫、驱虫，携带病原的几率往往远高于家养犬。

世界上已发现的人畜共患病有200多种，其中与宠物有直接或间接关系的有七十多种。宠物源人畜共患病的病原体传染性和致病力较强，而且部分病原体的致死率很高，应该引起极大关注和重视。近年来，一些新发的宠物源人畜共患病不断地被发现，病种不断地增多。

犬流感(CI)是由犬流感病毒(CIV)引起的以呼吸道症状为主的犬类传染性疾病。2004年，在犬体内发现马源犬流感病毒后，人源、猪源、禽源等多种不同动物来源的犬流感病毒相继出现。这些病毒在犬体内复制、重配，甚至通过犬传播至其他宿主，对其他动物甚至人类健康造成威胁。2009年11月我国有2例犬感染甲流报道，人禽流感可能由犬等感染。

新型冠状病毒肺炎的流行已经给人类的健康和生命造成极大危害，引起了各国科学界的强烈关注，并正在进行广泛深入的研究。冠状病毒是畜、禽、犬猫和人，特别是幼畜呼吸道及消化道炎症的病原。这些问题也凸显了动物传染病和人类传染病之间的联系。冠状病毒引起的动物疾病有很多种，犬冠状病毒(CCoV)在犬群中普遍存在，尤其在犬舍和动物收容所更加流行。

呼肠孤病毒在自然界中广泛存在，几乎可以从所有的哺乳动物体内检测到呼肠孤病毒，且已证实与许多人畜共患病有关。呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒的感染可导致畜禽和人的发病及死亡，给公共卫生安全以及畜禽养殖业带来严重威胁。而针对犬的呼肠孤病毒(CRV)报道较少，其常规的检测方法有病原分离鉴定和血清学方法，但是，这些方法的敏感性和特异性较低，且费时费力。

CIV、CCOV和CRV三种病原均存在感染人的风险，并且前期的流行病学监测发现该三种病原在健康家养犬中依然表现出较高的阳性率，近年来，建立了对CIV、CCOV、RV病毒的单一检测方法，但这些检测方法耗时较长，多重PCR检测技术是在单一PCR的基础上建立的检测方法。

尽管目前已经报道过CDV、CPV和CCOV病毒的三重检测方法，但病毒种类不同，检测条件也不同，对于CIV、CCOV和CRV三种病原的三重检测方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，可以对单一样品同时进行三种不同病原的检测，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，三重PCR在试验过程中也会降低因为污染而造成的假阳性率，以方便快速、准确地进行相关流行病学监测，为公共卫生安全提出预警，为潜在威胁人类健康的病原监测提供技术支持。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种犬流感病毒、犬冠状病毒和犬呼肠孤病毒的三重PCR检测方法，包括以下步骤：

1)查找犬流感病毒CIV、犬冠状病毒CCOV和犬呼肠孤病毒CRV的保守区序列；