[发明专利]一种重组的非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒跨膜蛋白J18L亚单位蛋白及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述制备方法如下：1)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒J18L蛋白编码基因序列克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白编码基因的重组质粒；2)再将所述含有非洲猪瘟病毒J18L亚单位蛋白编码基因的质粒重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞中，得到重组工程菌；3)中重组工程菌进行诱导表达，并从菌体裂解上清中纯化非洲猪瘟J18L亚单位蛋白。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟跨膜蛋白J18L亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种非洲猪瘟J18L蛋白制备方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。

该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。J18L蛋白由E199L基因编码的富含半胱氨酸的病毒跨膜蛋白。该基因含有195个氨基酸，分子量约21.7kDa，疏水结构在C端附近，可能作为膜受体起作用，也可能是作为膜锚定蛋白或者离子通道蛋白。该蛋白与痘病毒病毒进入融合复合物中的A16、G9和J5蛋白相似，介导非洲猪瘟病毒膜融合和病毒核衣壳蛋白释放。因此，J18L对病毒粒子的侵染非常关键，有可能是一个很好的保护性抗原。在当前没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有能够预防该疾病的亚单位蛋白具有重大的意义。

发明内容

在现有技术的基础上，本发明为了克服现有技术中存在的诸多缺陷(如昆虫杆状病毒制备成本较高、大肠杆菌中不能直接可溶性表达J18L等)，提供了一种可在大肠杆菌中直接可溶性表达J18L亚单位蛋白的大规模可溶性制备方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种可在大肠杆菌中表达J18L的优化后的opti-J18L的核苷酸的序列，所述OPTI-J18L核苷酸的序列如SEQ ID NO 1所示。

为了能够在大肠杆菌中高效可溶性表达J18L，本发明在opti-J18L的核苷酸的序列5’端加入TrxA伴侣蛋白的基因编码序列，得到opti-TrxA-J18L，所述OPTI-TrxA-J18L蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO 3所示，所述TrxA伴侣蛋白的基因编码序列如SEQ ID NO 5所示。

为了后续能够去除TrxA伴侣蛋白，本发明在TrxA与J18L中间插入了一种酶的酶切位点的基因编码序列，得到opti-TrxA-酶切位点-J18L。优选地，一种酶的酶切位点的基因编码序列为TEV酶切位点的基因编码序列，即为opti-TrxA-TEV-J18L，所述的TEV酶切位点的基因编码序列如SEQ ID NO 6所示。