[发明专利]一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于核苷酸适配体的金属探针及其制备方法和应用，涉及生物检测技术领域。该探针由¹⁶⁷Er金属阳离子、双功能聚合物和‑SHC₆‑A10‑3.2适配体组成。其制备方法为：双功能聚合物中三胺五乙酸(DTPA)螯合¹⁶⁷Er阳离子形成聚合物基¹⁶⁷Er镧系金属螯合物MCPs(¹⁶⁷Er),将螯合成功的MCPs(¹⁶⁷Er)和‑SHC₆‑A10‑3.2核酸适配体发生加成反应，生成基于核苷酸适配体的IMC探针。该金属探针可作为非侵入性诊断成像试剂，识别靶标物质、用于细胞系或组织的蛋白质的定量和定位分析。本发明公布的基于核苷酸适配体的金属探针具有高灵敏度、精准定位、染色准确性高等优势。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于核酸适配体的金属探针及其制备方法和应用。

背景技术

单细胞质谱成像技术(IMC)主要通过使用镧系金属同位素标记抗体(Antibody,Ab)，用质谱代替光谱作为检测方式，具有超低背景、通道间无干扰、多参数检测等完全区别于传统模式的优势特点。IMC技术具有应用方便，标记靶点多样，通量高等优点，在疾病诊疗、药物研发以及生物学基础研究等领域发挥着重要作用。与以前的组织分析方法相比，多通道IMC成像技术可以全面了解组织成分和生物标志物含量分布。现代医学研究需要对细胞或组织成像进行高维灵敏的多组分分析，以探究潜在疾病的复杂生物学机制。

目前IMC技术中的金属标签是由Fluidigm公司研发的聚合物基镧系金属螯合物(lanthanide metal-chelating polymers,MCPs(Ln))的金属试剂盒，探针是传统的具有优异识别性能的Ab。由于Ab存在着价格昂贵、稳定性差和重现性差等明显的缺点。因此，寻找IMC技术中新的小分子生物探针不仅具有重要的科学意义，而且具有巨大的经济价值。

核苷酸适配体(Aptamer)通常是通过一个称为配体系统进化的过程，即通过指数扩增技术(SELEX)在体外产生的能够与目标抗原高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA寡核苷酸，长度从15到100个核苷酸不等。Aptamer的核苷酸序列决定了其与目标分子特异性结合的三维结构。另外，它能对无机离子、有机小分子、多肽、蛋白、细菌、病毒和细胞等进行专一识别。与Ab比较，Aptamer具有合成容易、稳定性好和价格低廉的优势，筛选能识别特定蛋白或其特定结构域的Aptamer应用于组学分析、疾病诊断和信号通路调控等领域。Aptamer能够特异性地结合细胞表面标记物，已被用于开发多效价抗体类似物和荧光流式细胞仪分析。Zhang等筛选出的荧光标记的特异结合人CD30蛋白的RNA基Aptamer，通过流式细胞仪检测后结果显示:低浓度(0.3nM)的Aptamer就能特异地、敏感地检测到淋巴细胞上表达CD30抗原，与临床公认的诊断探针-Ab探针效果一样，从而认为该Aptamer可作为检测表达CD30的探针。Tan等通过cell-SELEX技术筛选得到针对过表达人表皮生长因子受体III型突变体的人脑胶质瘤细胞(U87-EGFRvIII)的Aptamer，其中一条序列与靶细胞共孵育时能定位于细胞核。经“pull-down”实验表明，该Aptamer能识别EGFRvIII蛋白，实验者推测，可能是由于Aptamer结合在EGFRvIII蛋白上，由于该蛋白介导的内吞作用而进入细胞，为细胞核靶向输送提供了颇有前景的分子工具。Yang课题组筛选出能够特异性识别肿瘤细胞上过表达的上皮细胞粘附分子(EpCAM)的Aptamer，可用于肿瘤细胞成像和循环肿瘤细胞捕获，此外他们还对筛选得到的Aptamer进行序列优化，经过优化的Aptamer-SYL3C对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系和胃癌细胞Kato III细胞系识别解离常数分别为(38±9)nmol/L和(67±8)nmol/L。其富集肿瘤细胞的效率达到63％，捕获后细胞的纯度为80％,可用于血液中肿瘤细胞的检测。Aptamer-AX102能够特异性靶向血管新生中的特定蛋白血小板源生长因子B(PDGF-B)，有利于捕捉癌细胞发生发展的过程。