[发明专利]一种重组质粒及其构建方法、重组影像系统与应用

说明书

本发明公开一种重组质粒及其构建方法、重组影像系统与应用。本发明针对MSI1/AGO2的蛋白‑蛋白交互作用，就生物光学‑萤光共振能量转移技术与萤光素酶分离互补系统在定性与定量上的可靠度、以及萤光素酶分离互补系统的优化进行探讨。经过测试不同长度与弹性/电荷分布的连接肽(linker peptide)，成功建构出一组较萤火虫萤光素酶(fireflyluciferase,FLuc)亮度高上千倍的桡脚类萤光素酶(Gaussia luciferase,GLuc)的重组影像系统；同时，萤火虫萤光素酶将作为定量分析时的标准化讯号。本发明将主要应用于临床前的细胞实验与动物实验，能够即时并且非侵入性地测量并定量脑肿瘤的治疗效果。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种重组质粒及其构建方法、重组影像系统与应用。

背景技术

恶性肿瘤的可视化在迈入21世纪的今日，无论在动物模式、药物前期开发、药代动力学、乃至于序贯治疗计画决断等方面，已经占据了生物医学方面科研面项的极大声量。分子影像学乃是一门针对分子机制可视化、具现化以及可量化等方面的学问。运用各种不同的分子设计与成像平台来达到非侵入式的分析。从20世纪60年代，绿色萤光蛋白为日本学者下村脩自海洋生物分离并定义以来，运用光学原理的各种影像技术应运而生。随着美籍华裔科学家钱永健对于绿色萤光蛋白的各种改良与研发，生物萤光影像在现今科研已经占有一席不可抹灭的地位。时至今日，各种运用萤光、生物冷光乃至于核子医学等多模态分子影像技术进行的科研项目不胜枚举。针对蛋白-蛋白交互作用的分子影像学研究已经颇具历史。在早期蛋白质组学领域，利用酵母菌双杂合系统(Yeast-2-hybrid system)已经相当成熟，然而其大多应用于真核生物，在哺乳类细胞内的效果并不显著。在生物化学的范畴内，免疫共沉淀实验被广为应用于验证蛋白-蛋白交互作用的主要工具，然而此技术完全无法应用于细胞，更遑论活体内的应用。随着萤光蛋白与生物光学的广泛研究，利用两个供体与受体生色团(chromophore)重叠的发散与激发光频谱形成的能量传递，可以做为特定分子足够靠近的证据，如此技术被称之为荧光共振能量转移(FRET)。而这项技术也在共聚焦显微成像技术成熟的今日，被大量地使用在动态观察分子交互作用的研究上。相较于前述几项技术，FRET在细胞生理学上的应用可见一斑，由于其具备量化与追踪的功能，使得分子信息得以可视化，可谓一大进步；然而，此技术由于仰赖雷射激活，而使得活体内的应用备受限制。一项取代激发光的生物光学-萤光共振能量转移技术(BRET)应运而生。此技术使用萤光素酶作为激发光源，由于萤光素酶发光仅需能量与受质，因此不受激发光源穿透组织的能量衰减影响，可以有效地将交互作用实时地藉由光学讯号表达出来。近来，另一类型的蛋白-蛋白交互作用影像系统被相继开发面世，萤光素酶分离互补系统(split luciferasecomplementation system)作为代表性的设计而为人熟知。概念上，首先将萤光素酶分为两段，将两个可能互结合的受测蛋白质分别标志上其中一段萤光素酶。倘若两个受测蛋白质因为蛋白-蛋白交互作用而足够靠近，两个萤光素酶片段或其结构将有可能重新结合而重新激活萤光素酶活性，发出光讯号。为了增加萤光素酶再激活的效率，许多修正版本的设计也如雨后春笋般出现，如使用Ozawa等人发表来自集胞藻属的内含肽(intein)序列加于萤光素酶的一端增加重合的机率，并且有效地非侵入地侦测动物体内的光讯号。