[发明专利]一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法

说明书

本发明属于细胞生物学检测技术领域，公开了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，包括：制备葡萄籽提取物，加水稀释获得花青素溶液；将建模小鼠进行高脂饲料饲养28天；令小鼠空腹6小时后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖浓度；对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食28天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；使用试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的观察。本发明使用葡萄籽提取物作为花青素来源进行小鼠胰岛β细胞自噬效果检测，检测效果更好；糖尿病小鼠建模能够实现对糖尿病病体组织的获取，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒仅需进行切片的洗涤和染色，检测效果展现更直观。

技术领域

本发明属于细胞生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。

背景技术

目前，自噬是细胞利用溶酶体降解已受损的大分子物质和细胞器的过程，自噬连续不断清理错误折叠的蛋白质、有害的代谢产物、老化的线粒体等细胞器，从而保持胰岛β细胞的正常状态。研究表明，花青素具有很强的自由基清除和抗氧化活性能力，在预防心血管疾病、肿瘤、糖尿病中发挥着重要的作用。桑树果实花色苷提取物素通过抗氧化应激抑制胰岛β细胞凋亡，从而预防糖尿病。但是目前暂无检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，无法为糖尿病防治提供理论依据。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前暂无检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，无法为糖尿病防治提供理论依据。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。

本发明是这样实现的，一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：

步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末。

步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A。

步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍。

步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物。

步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物。

步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂。

步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型。

步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞。

步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中。

步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀。

步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO₂浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型。