[发明专利]一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法

权利要求书

1.一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：

步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末；

步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A；

步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍；

步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物；

步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物；

步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂；

步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型；

步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞；

步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中；

步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀；

步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO₂浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤十二，将培养后的小鼠胰岛β细胞使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；

步骤十三，使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒，并将已固定的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡；

步骤十四，依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1min；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色，并室温孵育10min；使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒胰岛β细胞凋亡情况的显示结果。

2.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤四中，所述超声提取中的超声频率为35～45Hz，超声时间为30～40min，超声提取温度为40～50℃。

3.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤五中，所述用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物时，低温等离子体气氛为体积比为1～2:1的O₂和N₂。

4.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤六中，所述减压浓缩的条件为-0.05～-0.1MPa，40～65℃；所述喷雾时的进口温度为180～200℃，出口温度为85～95℃。

5.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤七中，所述建模小鼠为3～5月龄的雄性SD小鼠，体重为200～240克。

6.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤七中，所述高脂饲料按照质量份数由麸皮10～15份、玉米10～12份、豆粕8～15份、酪蛋白6～8份、麦芽糊精10～12份、大豆油3～6份、胆固醇1～2份组成。

7.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤八中，所述对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食时，花青素溶液摄入量为每天10ml。