[发明专利]一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用

说明书

本发明公开了一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用，所述方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向Fzd6基因的第4个外显子，在对应位置设计并合成sgRNA，然后将体外转录的sgRNA/Cas9一起显微注射入小鼠的受精卵中，再将受精卵移植到假孕母鼠子宫中，获得F0代小鼠，然后通过PCR和测序鉴定阳性的小鼠，与野生型背景鼠回交后，获得单一基因型的杂合子小鼠，然后在杂合子小鼠之间杂交繁育获得纯合子小鼠，即所构建的Fzd6基因敲除小鼠，经测序发现其序列在目标位置发生5个碱基的缺失并导致移码突变，该模型小鼠可用于研究FZD6在所参与的癌症、神经发育、血液病及精神类疾病中的作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域,，尤其涉及一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用。

背景技术

Frizzleds(FZD)蛋白家族是Wnt/β-catenin信号通路中的一类特异性受体，是一类跨膜蛋白，位于细胞质膜上。这些受体通过与Wnt信号分子结合，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而激活下游的靶基因而对机体发挥功能。在哺乳动物中，FZD蛋白家族共包含10个成员，进化上有一定的保守性，在细胞中广泛表达，并且在不同的动物和组织中都有保守的结构，即：在N端含有一个富含半胱氨酸的CRD(cysteine rich domain)结构域，在C端含有一个保守的KTXXXW结构域。研究发现，FZD蛋白家族的成员在动物发育过程中和癌症中起着非常重要的作用。

FZD6是FZD蛋白家族中的一员，小鼠的Fzd6基因位于第15号染色体(39,006,034-39,038,188)，基因全长32044bp，包含有7个外显子，5个转录本，其中2号转录本最长，为4325bp，共编码709个氨基酸。人的FZD6基因结构与小鼠的相似，有很高的同源性和保守性，共有8个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，其中4个为错义突变SNP，两个位于第四个外显子上。FZD6已被报道在神经管畸形、毛发的发育、血液病、精神类疾病以及癌症中都发挥着非常重要的作用，因此构建该基因敲除的小鼠模型非常重要。

目前常用的构建基因敲除小鼠的方法包括：转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)技术、胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)打靶技术等，然而这些方法的构建周期长，成本高，存在一定的脱靶问题。而目前已有的对Fzd6基因进行敲除的动物模型主要是在脑的特定位置通过慢病毒注射的方法或通过上述基因编辑技术进行敲除的，更多的使用的是小干扰RNA(siRNA)方法进行敲低的模型，尚无使用更新的技术对Fzd6基因进行敲除的小鼠模型。

发明内容

鉴于此，本发明实施例的目的是提供一种基于最新的基因编辑技术构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用，以解决目前常用的构建基因敲除小鼠的过程周期长，成本高，操作繁琐的问题，也为研究FZD6在其所参与的疾病中的生物学功能提供了小鼠模型。

根据本发明实施例的第一方面，提供一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法，包括：

(1)确定小鼠待敲除基因的特异性靶位点，针对小鼠Fzd6基因的第四个外显子设计sgRNA序列，所述的特异性的sgRNA序列为SEQ ID NO.1；

(2)使用所述的sgRNA构建sgRNA/Cas9表达载体；

(3)将所述的sgRNA/Cas9表达载体线性化并纯化后，体外转录合成sgRNA和Cas9mRNA；

(4)将上述sgRNA和Cas9 mRNA一起显微注射到小鼠的受精卵中；

(5)将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠中，出生的小鼠即F0代小鼠，通过PCR反应和Sanger测序确认是野生型小鼠或阳性杂合子小鼠；